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对脊髓损伤的保护作用研究
[摘要] 目的 观察糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链（GILZ）对脊髓损伤的保护作用。方法 T淋巴细胞GILZ转基因小鼠及野生型小鼠（WT）造脊髓损伤模型，观察GILZ对脊髓损伤的保护作用以及机制。结果 GILZ小鼠在脊髓损伤后的组织学评分为1.1，显著低于WT模型小鼠的4.2。WT小鼠的GFAP表达、促炎因子表达、CD4和CD8型T细胞表达和细胞凋亡在脊髓损伤后均显著增强。而GILZ模型小鼠均可以降低上述反应。GILZ通过抑制NFκB的核转移抑制炎症反应，抑制凋亡基因和增强抗凋亡基因减少细胞凋亡。结论 T淋巴细胞高表达糖皮质激素可以对小鼠脊髓损伤产生保护作用，GILZ可以作为脊髓损伤的治疗靶点。
[关键词] 糖皮质激素；亮氨酸拉链；脊髓损伤；T淋巴细胞；细胞因子；凋亡
Protective effects of glucocorticoid-induced leucine zipper in spinal cord injury in mice
[Abstract] Objective To determine the protective effects of glucocorticoid-induced leucine zipper in spinal cord injury in mice. Methods T lymphocyte GILZ transgenic mice and wild-type mice (WT) underwent spinal cord injury model, and the protective effect and mechanism of GILZ on spinal cord injury were also observed. Results The histological score in GILZ mice underwent spinal cord injury was 1.1, which was significantly lower than that of WT model mice of 4.2. The expression of GFAP, pro-inflammatory factor, CD4 and CD8 T cells, as well as apoptosis in WT mice were significantly enhanced after spinal cord injury. Reduction of above reaction in GILZ model mice were all observed. The anti-inflammation or anti-apoptosis of GILZ were through prevention of NFκB translocation and elevation of anti-apoptotic gene expression. Conclusion T lymphocyte highly expressed glucocorticoid can protect the spinal cord injury in mice. GILZ can be used as the target for the treatment of spinal cord injury.
[Key words] Glucocorticoid; Leucine Zipper; T Lymphocyte; Cytokine; Apoptosis
炎症反应以自我平衡的方式与很多疾病的调控中起着重要的作用，创伤后刺激会引起一系列炎症反应的激活。炎症反应会在脊髓损伤后的二次损伤中具有重要的作用[1]。初次的脊髓损伤会引起脊髓神经元的凋亡及不可再生。然而，脊髓神经元会出现持续数小时的连续的凋亡[2]。此外，有研究证实[3]，二次性的神经元死亡与细胞的炎症反应密切相关。白细胞，尤其是T淋巴细胞和中性粒细胞浸润脊髓对脊髓损伤后的病理过程和发展起着重要的作用。同时，在脊髓损伤模型中也观察到了炎症细胞浸润、炎症介质释放、水肿形成、神经元凋亡和组织损伤等炎症反应症状[2]。
尽管对于脊髓损伤的研究已经出现了很大的进展，但是其治疗仍然面临着很大的问题。目前临床上常用的药物主要为人工合成的糖皮质激素类药物甲泼尼龙，一般在损伤3-8小时内给药[4,5]。甲泼尼龙可以减少脊髓损伤后自由基引起的脂质过氧化和少突胶质细胞的凋亡[4]。但是糖皮质激素治疗中枢神经系统损伤的机制目前还不完全清楚。有研究显示，糖皮质激素对帕金森病的神经保护作用是由于抗炎的作用。作为常用的治疗脊髓损伤的药物，糖皮质激素通过抑制T淋巴细胞的激活、迁移和进入损伤部位而产生抗炎作用。这些效应主要是糖皮质激素与细胞质受体的相互作用，接着抑制了NF-κB的激活和核转移[6]。然而在临床上糖皮质激素治疗脊髓损伤的作用经常很短暂，而且逐渐减少药物后还会引起疾病的复发，且长期使用糖皮质激素还会引起严重的副作用。之前的研究表明，地塞米松可以激活糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链（GILZ，glucocorticoid-induced leucine zipper），抑制T淋巴细胞的激活。GILZ通过COOH末端特异性的氨基酸与NF-κB形成同源二聚体构象产生作用[7]。此外，GILZ还可以作用于Ras依赖的MAPK通路，抑制其下游的通路，包括NF-κB通路[8]。因此可见GILZ可以通过不同的途径抑制NF-κB的激活而产生抗炎作用。
因此，在本次研究中，我们使用T淋巴细胞GILZ过表达的转基因小鼠研究GILZ对脊髓损伤的保护作用以及与T细胞的相关机制。
材料与方法
1材料: C57BL/6雄性小鼠，8-10周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003。C57BL/6来源的GILZTG转基因雄性小鼠，8-10周龄，由赛业生物有限公司提供。所有动物饲养于实验动物独立通风系统（苏州市苏杭科技器材有限公司），环境温度保持在22℃左右，湿度保持在55%左右，光照时间为7:00-19:00，添加足够的饲料和饮水。戊巴比妥钠，美国sigma公司生产；多聚甲醛，阿拉丁试剂有限公司；TUNEL法试剂盒检测（Millipore公司）；Elisa试剂盒（TNF-α、IL-10和IL-1β）均购自美国R&D公司。其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
2脊髓损伤（SCI）模型: 小鼠脊髓损伤模型参照董洲等的报道[9]，小鼠使用戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉。将麻醉后小鼠俯位固定，背部正中去毛，用碘伏和酒精消毒，行纵向切口。钝性分离脊柱旁肌肉暴露T5-T8的脊柱，通过T5-T8脊柱的椎板切除术暴露脊髓，使用动脉夹夹闭T6-T7段脊髓1 min，缝合肌肉和皮肤后放入干净笼中恢复，为防止小鼠间出现撕咬，术后24 h 内均单笼饲养。假手术组仅暴露脊髓，其他操作如模型小鼠。
3脊髓组织提取及Western Blot: 取脊髓组织进行匀浆，提取总蛋白。使用BCA试剂盒对总蛋白进行定量后进行蛋白电泳，使用β-actin蛋白作为内参。，将50 μg蛋白与上样缓冲液煮沸10 min，上10%SDS-PAGE电泳,结束后转膜，将凝胶取出，在电转仪内使用恒压400 V将蛋白转转移到PVDF膜上。使用5%脱脂牛奶封闭膜1 h。将内参以及目的蛋白的一抗分别用TBST稀释4℃孵育过夜。TBST洗脱后加入各自的二抗室温孵育1 h。TBST洗脱后使用在BioRad公司Gel Doc XR凝胶成像系统中ECL发光法曝光。结果使用Image J软件对出灰度值进行半定量。
4免疫组织化学检测: 脊髓组织在损伤24 h后使用4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋切片（5 μm），二甲苯去石蜡后使用0.3%过氧化氢淬灭30 min，切片使用0.1%Triton-X通透20 min，内源性的生物素结合位点分别使用生物素等孵育15 min。分别孵育相应的一抗和二抗后，使用荧光显微镜拍照。
5病理组织学检查: 脊髓组织在损伤24 h后使用4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋切片（5 μm），二甲苯去石蜡后使用HE染色，光镜检查。脊髓损伤使用0-6分的评分标准，0-无损伤，1-灰质包含1-5嗜酸性神经元，2-灰质包含5-10嗜酸性神经元，3-灰质包含超过10个嗜酸性神经元，4-少于1/3的灰质出现梗塞，5- 1/3至1/2的灰质出现梗塞，6- 超过1/2的灰质出现梗塞。
6 统计学方法: 使用SPSS 18.0软件进行统计分析，所有数据用均数±标准差(
±s)表示，组间比较采用单因素方差分析post-hoc Dunnett检验，P<0.05表示结果有统计学意义。
结果
1糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤的保护作用: 分别取小鼠32只，分为4组，分别为野生型（WT）假手术组（Sham，n=8）、野生型（WT）模型组（Model，n=8）、转基因（GILZ）假手术组（Sham，n=8）、转基因（GILZ）模型组（Model，n=8）。分别检测术后24 h野生型小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓损伤后的病理评分，并检查胶质细胞标志物GFAP的mRNA和蛋白在脊髓组织的表达。结果显示，WT小鼠及GILZ转基因小鼠假手术组的脊髓病理评分均为0，脊髓GFAP表达也接近于0，表明未出现胶质细胞的激活。而进行脊髓损伤模型后，WT小鼠的病理组织学评分为4.2分，显著高于GILZ小鼠的1.1分（P＜0.05）。同时，WT小鼠的GFAP mRNA水平以及蛋白表达均显著高于GILZ小鼠（P＜0.05）。
图1糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。A，WT-Sham；B，GILZ-Sham；C，WT-Model; D，GILZ-Model。
图2糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓GFAP表达的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
同时，使用免疫组织化学检测了各组小鼠脊髓CD4+和CD8a+型T细胞表达。结果显示，脊髓损伤24 h后CD4+和CD8a+型T细胞表达显著增加，而GILZ可以减少其表达。
图3 糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓CD8和CD4型T细胞表达的影响。A和E，WT-Sham；B和F，GILZ-Sham；C和G，WT-Model; D和H，GILZ-Model。
2糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤小鼠脊髓MPO、TNF-α、、IL-1β和IL-10含量的影响: 分别取小鼠32只，分为4组，分别为野生型（WT）假手术组（n=8）、野生型（WT）模型组（n=8）、转基因（GILZ）假手术组（n=8）、转基因（GILZ）模型组（n=8）。分别使用Elisa试剂盒检测术后24 h WT小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓MPO、TNF-α、IL-10和IL-1β的含量。结果显示，两组假手术组小鼠脊髓组织的MPO、TNF-α、IL-10和IL-1β的含量均较低，而脊髓损伤24 h后WT小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓的TNF-α、IL-10和IL-1β含量均显著升高（P＜0.05），GILZ的小鼠在脊髓损伤后脊髓组织的MPO、TNF-α和IL-1β的含量均低于野生型小鼠（P＜0.05），IL-10则显著高于WT小鼠（P＜0.05）。
图4糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓MPO（A）、IL-10（B）、TNF-α（C）和IL-1β（D）含量的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
3 糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对IκBα降解及核转录因子NFκBp65的影响:
NFκB通路在T细胞激活中起着重要的作用。分别取小鼠32只，分为4组分别
为野生型（WT）假手术组（n=8）、野生型（WT）模型组（n=8）、转基因（GILZ）
假手术组（n=8）、转基因（GILZ）模型组（n=8）。分别检测了各组小鼠术后24
h脊髓损伤后IκBα及核转录因子NFκB（NFκB p65）的蛋白表达。结果如图所
示，WT小鼠在脊髓损伤24 h后IκBα表达显著升高（P＜0.05），而GILZ小鼠
则可以显著降低IκBα蛋白的表达（P＜0.05）。同时，GILZ还可以减少小鼠在脊
髓损伤24 h后NFκB p65的升高（P＜0.05）。
图5 糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对IκBα降解及核转录因子NFκBp65的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
4糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤小鼠脊髓细胞凋亡的影响: 分别取小鼠32只，分为4组，分别为野生型（WT）假手术组（n=8）、野生型（WT）模型组（n=8）、转基因（GILZ）假手术组（n=8）、转基因（GILZ）模型组（n=8）。分别使用TUNEL试剂盒检测术后24 h WT小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓细胞凋亡。结果显示，WT小鼠及GILZ转基因小鼠假手术组的细胞凋亡均接近0，而进行脊髓损伤模型后，WT小鼠的细胞凋亡显著高于GILZ小鼠（P＜0.05），表明GILZ可以降低脊髓损伤小鼠脊髓的细胞凋亡。
图6糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓细胞凋亡的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
同时检测各组小鼠脊髓凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达，结果显示，与假手术相比，WT小鼠在脊髓损伤24 h后Bax蛋白表达显著增高，而Bcl-2蛋白的表达显著降低（P＜0.05）。而GILZ小鼠的Bax蛋白表达显著低于野生型模型小鼠，而Bcl-2蛋白的表达则显著降低（P＜0.05）。
图7糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对Bax和Bcl-2表达的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
讨论
本次研究的结果显示，GILZ过表达的小鼠在脊髓损伤后与WT小鼠相比，损伤程度显著减轻，抑制了NF-κB的激活和T细胞迁移至炎症组织，也表明T淋巴细胞在脊髓损伤的发生和发展过程中起着重要的作用。脊髓损伤后会引起一系列神经组织的病理改变，主要包括神经元的活性和存活。主要的组织损伤是由于免疫细胞的浸润，包括T淋巴细胞，释放促炎因子所引起。
为了应对抗原的刺激和组织损伤，激活的淋巴细胞必须从血液进入组织。在脊髓损伤的早期，激活的T淋巴细胞参与了细胞浸润到损伤组织[10,11]。本次研究中我们发现CD4+和CD8αT细胞在脊髓损伤后表达大量增加，而在GILZ表达增加后，T淋巴细胞的浸润显著降低，表明GILZ具有抑制T淋巴细胞的能力而具有抗炎作用。这与其他体内和体外研究中，GILZ可以抑制T淋巴细胞的激活、炎症因子的释放以及炎症反应过程的结果是一致的。同时，与前期的GILZ可以抑制NF-κB的激活一致，本次研究中GILZ转基因小鼠可以减少脊髓损伤后引起的NF-κB的激活[12]。在实验性脊髓损伤后12-72 h，炎症因子及其受体如TNF-α、IL-10和IL-1β的含量均显著增加。促炎因子还可以引起髓鞘的退化和神经元的凋亡导致神经病理学的改变[13]。本次研究可见GILZ可以显著降低TNF-α和IL-1β这些炎症发展过程中很重要的促炎因子的含量。NF-κB的激活可以导致炎症因子的产生，这些结果与抑制NF-κB激活的结果是相一致的。
脊髓损伤24 h后出现退化，在接下来几天会加重，并出现灰质和白质少突胶质细胞的凋亡和囊肿的形成[14-16]。GILZ过表达可以显著减少脊髓损伤引起的神经细胞凋亡。在细胞凋亡的过程中，凋亡相关基因如Bax和Bcl-2等起着关键的作用。Bcl-2 基因广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种肿瘤细胞，可抑制各种刺激下多种细胞的凋亡。Bax 基因属于Bcl-2 基因家族，编码的Bax 蛋白可与Bcl-2 形成异二聚体，对Bcl-2 产生抑制作用[17,18]。研究表明，Bax/Bcl-2 两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此Bax 是极重要的促细胞凋亡基因。本次研究可见，GILZ过表达可以显著减少Bax基因的表达，增加Bcl-2的作用，达到了减少细胞凋亡的作用。
综合以上可以看出，糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链可以抑制脊髓损伤后T淋巴细胞的激活、NF-κB的激活以及神经细胞的凋亡，可以作为脊髓损伤治疗的一个重要靶点。
参考文献
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[关键词] 糖皮质激素；亮氨酸拉链；脊髓损伤；T淋巴细胞；细胞因子；凋亡
Protective effects of glucocorticoid-induced leucine zipper in spinal cord injury in mice
[Abstract] Objective To determine the protective effects of glucocorticoid-induced leucine zipper in spinal cord injury in mice. Methods T lymphocyte GILZ transgenic mice and wild-type mice (WT) underwent spinal cord injury model, and the protective effect and mechanism of GILZ on spinal cord injury were also observed. Results The histological score in GILZ mice underwent spinal cord injury was 1.1, which was significantly lower than that of WT model mice of 4.2. The expression of GFAP, pro-inflammatory factor, CD4 and CD8 T cells, as well as apoptosis in WT mice were significantly enhanced after spinal cord injury. Reduction of above reaction in GILZ model mice were all observed. The anti-inflammation or anti-apoptosis of GILZ were through prevention of NFκB translocation and elevation of anti-apoptotic gene expression. Conclusion T lymphocyte highly expressed glucocorticoid can protect the spinal cord injury in mice. GILZ can be used as the target for the treatment of spinal cord injury.
[Key words] Glucocorticoid; Leucine Zipper; T Lymphocyte; Cytokine; Apoptosis
炎症反应以自我平衡的方式与很多疾病的调控中起着重要的作用，创伤后刺激会引起一系列炎症反应的激活。炎症反应会在脊髓损伤后的二次损伤中具有重要的作用[1]。初次的脊髓损伤会引起脊髓神经元的凋亡及不可再生。然而，脊髓神经元会出现持续数小时的连续的凋亡[2]。此外，有研究证实[3]，二次性的神经元死亡与细胞的炎症反应密切相关。白细胞，尤其是T淋巴细胞和中性粒细胞浸润脊髓对脊髓损伤后的病理过程和发展起着重要的作用。同时，在脊髓损伤模型中也观察到了炎症细胞浸润、炎症介质释放、水肿形成、神经元凋亡和组织损伤等炎症反应症状[2]。
尽管对于脊髓损伤的研究已经出现了很大的进展，但是其治疗仍然面临着很大的问题。目前临床上常用的药物主要为人工合成的糖皮质激素类药物甲泼尼龙，一般在损伤3-8小时内给药[4,5]。甲泼尼龙可以减少脊髓损伤后自由基引起的脂质过氧化和少突胶质细胞的凋亡[4]。但是糖皮质激素治疗中枢神经系统损伤的机制目前还不完全清楚。有研究显示，糖皮质激素对帕金森病的神经保护作用是由于抗炎的作用。作为常用的治疗脊髓损伤的药物，糖皮质激素通过抑制T淋巴细胞的激活、迁移和进入损伤部位而产生抗炎作用。这些效应主要是糖皮质激素与细胞质受体的相互作用，接着抑制了NF-κB的激活和核转移[6]。然而在临床上糖皮质激素治疗脊髓损伤的作用经常很短暂，而且逐渐减少药物后还会引起疾病的复发，且长期使用糖皮质激素还会引起严重的副作用。之前的研究表明，地塞米松可以激活糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链（GILZ，glucocorticoid-induced leucine zipper），抑制T淋巴细胞的激活。GILZ通过COOH末端特异性的氨基酸与NF-κB形成同源二聚体构象产生作用[7]。此外，GILZ还可以作用于Ras依赖的MAPK通路，抑制其下游的通路，包括NF-κB通路[8]。因此可见GILZ可以通过不同的途径抑制NF-κB的激活而产生抗炎作用。
因此，在本次研究中，我们使用T淋巴细胞GILZ过表达的转基因小鼠研究GILZ对脊髓损伤的保护作用以及与T细胞的相关机制。
材料与方法
1材料: C57BL/6雄性小鼠，8-10周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司，实验动物合格证号：SCXK(沪)2003-0003。C57BL/6来源的GILZTG转基因雄性小鼠，8-10周龄，由赛业生物有限公司提供。所有动物饲养于实验动物独立通风系统（苏州市苏杭科技器材有限公司），环境温度保持在22℃左右，湿度保持在55%左右，光照时间为7:00-19:00，添加足够的饲料和饮水。戊巴比妥钠，美国sigma公司生产；多聚甲醛，阿拉丁试剂有限公司；TUNEL法试剂盒检测（Millipore公司）；Elisa试剂盒（TNF-α、IL-10和IL-1β）均购自美国R&D公司。其他化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
2脊髓损伤（SCI）模型: 小鼠脊髓损伤模型参照董洲等的报道[9]，小鼠使用戊巴比妥钠（60 mg/kg）腹腔注射麻醉。将麻醉后小鼠俯位固定，背部正中去毛，用碘伏和酒精消毒，行纵向切口。钝性分离脊柱旁肌肉暴露T5-T8的脊柱，通过T5-T8脊柱的椎板切除术暴露脊髓，使用动脉夹夹闭T6-T7段脊髓1 min，缝合肌肉和皮肤后放入干净笼中恢复，为防止小鼠间出现撕咬，术后24 h 内均单笼饲养。假手术组仅暴露脊髓，其他操作如模型小鼠。
3脊髓组织提取及Western Blot: 取脊髓组织进行匀浆，提取总蛋白。使用BCA试剂盒对总蛋白进行定量后进行蛋白电泳，使用β-actin蛋白作为内参。，将50 μg蛋白与上样缓冲液煮沸10 min，上10%SDS-PAGE电泳,结束后转膜，将凝胶取出，在电转仪内使用恒压400 V将蛋白转转移到PVDF膜上。使用5%脱脂牛奶封闭膜1 h。将内参以及目的蛋白的一抗分别用TBST稀释4℃孵育过夜。TBST洗脱后加入各自的二抗室温孵育1 h。TBST洗脱后使用在BioRad公司Gel Doc XR凝胶成像系统中ECL发光法曝光。结果使用Image J软件对出灰度值进行半定量。
4免疫组织化学检测: 脊髓组织在损伤24 h后使用4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋切片（5 μm），二甲苯去石蜡后使用0.3%过氧化氢淬灭30 min，切片使用0.1%Triton-X通透20 min，内源性的生物素结合位点分别使用生物素等孵育15 min。分别孵育相应的一抗和二抗后，使用荧光显微镜拍照。
5病理组织学检查: 脊髓组织在损伤24 h后使用4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋切片（5 μm），二甲苯去石蜡后使用HE染色，光镜检查。脊髓损伤使用0-6分的评分标准，0-无损伤，1-灰质包含1-5嗜酸性神经元，2-灰质包含5-10嗜酸性神经元，3-灰质包含超过10个嗜酸性神经元，4-少于1/3的灰质出现梗塞，5- 1/3至1/2的灰质出现梗塞，6- 超过1/2的灰质出现梗塞。
6 统计学方法: 使用SPSS 18.0软件进行统计分析，所有数据用均数±标准差(
结果
1糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤的保护作用: 分别取小鼠32只，分为4组，分别为野生型（WT）假手术组（Sham，n=8）、野生型（WT）模型组（Model，n=8）、转基因（GILZ）假手术组（Sham，n=8）、转基因（GILZ）模型组（Model，n=8）。分别检测术后24 h野生型小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓损伤后的病理评分，并检查胶质细胞标志物GFAP的mRNA和蛋白在脊髓组织的表达。结果显示，WT小鼠及GILZ转基因小鼠假手术组的脊髓病理评分均为0，脊髓GFAP表达也接近于0，表明未出现胶质细胞的激活。而进行脊髓损伤模型后，WT小鼠的病理组织学评分为4.2分，显著高于GILZ小鼠的1.1分（P＜0.05）。同时，WT小鼠的GFAP mRNA水平以及蛋白表达均显著高于GILZ小鼠（P＜0.05）。
图1糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。A，WT-Sham；B，GILZ-Sham；C，WT-Model; D，GILZ-Model。
图2糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓GFAP表达的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
同时，使用免疫组织化学检测了各组小鼠脊髓CD4+和CD8a+型T细胞表达。结果显示，脊髓损伤24 h后CD4+和CD8a+型T细胞表达显著增加，而GILZ可以减少其表达。
图3 糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓CD8和CD4型T细胞表达的影响。A和E，WT-Sham；B和F，GILZ-Sham；C和G，WT-Model; D和H，GILZ-Model。
2糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤小鼠脊髓MPO、TNF-α、、IL-1β和IL-10含量的影响: 分别取小鼠32只，分为4组，分别为野生型（WT）假手术组（n=8）、野生型（WT）模型组（n=8）、转基因（GILZ）假手术组（n=8）、转基因（GILZ）模型组（n=8）。分别使用Elisa试剂盒检测术后24 h WT小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓MPO、TNF-α、IL-10和IL-1β的含量。结果显示，两组假手术组小鼠脊髓组织的MPO、TNF-α、IL-10和IL-1β的含量均较低，而脊髓损伤24 h后WT小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓的TNF-α、IL-10和IL-1β含量均显著升高（P＜0.05），GILZ的小鼠在脊髓损伤后脊髓组织的MPO、TNF-α和IL-1β的含量均低于野生型小鼠（P＜0.05），IL-10则显著高于WT小鼠（P＜0.05）。
图4糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓MPO（A）、IL-10（B）、TNF-α（C）和IL-1β（D）含量的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
3 糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对IκBα降解及核转录因子NFκBp65的影响:
NFκB通路在T细胞激活中起着重要的作用。分别取小鼠32只，分为4组分别
为野生型（WT）假手术组（n=8）、野生型（WT）模型组（n=8）、转基因（GILZ）
假手术组（n=8）、转基因（GILZ）模型组（n=8）。分别检测了各组小鼠术后24
h脊髓损伤后IκBα及核转录因子NFκB（NFκB p65）的蛋白表达。结果如图所
示，WT小鼠在脊髓损伤24 h后IκBα表达显著升高（P＜0.05），而GILZ小鼠
则可以显著降低IκBα蛋白的表达（P＜0.05）。同时，GILZ还可以减少小鼠在脊
髓损伤24 h后NFκB p65的升高（P＜0.05）。
图5 糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对IκBα降解及核转录因子NFκBp65的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
4糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓损伤小鼠脊髓细胞凋亡的影响: 分别取小鼠32只，分为4组，分别为野生型（WT）假手术组（n=8）、野生型（WT）模型组（n=8）、转基因（GILZ）假手术组（n=8）、转基因（GILZ）模型组（n=8）。分别使用TUNEL试剂盒检测术后24 h WT小鼠及过表达GILZ的小鼠脊髓细胞凋亡。结果显示，WT小鼠及GILZ转基因小鼠假手术组的细胞凋亡均接近0，而进行脊髓损伤模型后，WT小鼠的细胞凋亡显著高于GILZ小鼠（P＜0.05），表明GILZ可以降低脊髓损伤小鼠脊髓的细胞凋亡。
图6糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对脊髓细胞凋亡的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
同时检测各组小鼠脊髓凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达，结果显示，与假手术相比，WT小鼠在脊髓损伤24 h后Bax蛋白表达显著增高，而Bcl-2蛋白的表达显著降低（P＜0.05）。而GILZ小鼠的Bax蛋白表达显著低于野生型模型小鼠，而Bcl-2蛋白的表达则显著降低（P＜0.05）。
图7糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链对Bax和Bcl-2表达的影响。*，与WT小鼠相比，P＜0.05；#，与Sham小鼠相比，P＜0.05。
讨论
本次研究的结果显示，GILZ过表达的小鼠在脊髓损伤后与WT小鼠相比，损伤程度显著减轻，抑制了NF-κB的激活和T细胞迁移至炎症组织，也表明T淋巴细胞在脊髓损伤的发生和发展过程中起着重要的作用。脊髓损伤后会引起一系列神经组织的病理改变，主要包括神经元的活性和存活。主要的组织损伤是由于免疫细胞的浸润，包括T淋巴细胞，释放促炎因子所引起。
为了应对抗原的刺激和组织损伤，激活的淋巴细胞必须从血液进入组织。在脊髓损伤的早期，激活的T淋巴细胞参与了细胞浸润到损伤组织[10,11]。本次研究中我们发现CD4+和CD8αT细胞在脊髓损伤后表达大量增加，而在GILZ表达增加后，T淋巴细胞的浸润显著降低，表明GILZ具有抑制T淋巴细胞的能力而具有抗炎作用。这与其他体内和体外研究中，GILZ可以抑制T淋巴细胞的激活、炎症因子的释放以及炎症反应过程的结果是一致的。同时，与前期的GILZ可以抑制NF-κB的激活一致，本次研究中GILZ转基因小鼠可以减少脊髓损伤后引起的NF-κB的激活[12]。在实验性脊髓损伤后12-72 h，炎症因子及其受体如TNF-α、IL-10和IL-1β的含量均显著增加。促炎因子还可以引起髓鞘的退化和神经元的凋亡导致神经病理学的改变[13]。本次研究可见GILZ可以显著降低TNF-α和IL-1β这些炎症发展过程中很重要的促炎因子的含量。NF-κB的激活可以导致炎症因子的产生，这些结果与抑制NF-κB激活的结果是相一致的。
脊髓损伤24 h后出现退化，在接下来几天会加重，并出现灰质和白质少突胶质细胞的凋亡和囊肿的形成[14-16]。GILZ过表达可以显著减少脊髓损伤引起的神经细胞凋亡。在细胞凋亡的过程中，凋亡相关基因如Bax和Bcl-2等起着关键的作用。Bcl-2 基因广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种肿瘤细胞，可抑制各种刺激下多种细胞的凋亡。Bax 基因属于Bcl-2 基因家族，编码的Bax 蛋白可与Bcl-2 形成异二聚体，对Bcl-2 产生抑制作用[17,18]。研究表明，Bax/Bcl-2 两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此Bax 是极重要的促细胞凋亡基因。本次研究可见，GILZ过表达可以显著减少Bax基因的表达，增加Bcl-2的作用，达到了减少细胞凋亡的作用。
综合以上可以看出，糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链可以抑制脊髓损伤后T淋巴细胞的激活、NF-κB的激活以及神经细胞的凋亡，可以作为脊髓损伤治疗的一个重要靶点。
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