程序性坏死特异性抑制剂-1促进大鼠脊髓损伤修复的实验研究
【摘要】 目的 观察鞘内注射程序性坏死特异性抑制剂-1 (Nec-1) 对大鼠对脊髓损伤修复的促进作用。方法 SD大鼠30只，采用改良Allen’s法建立大鼠脊髓损伤模型，按照随机数字表法分为3组，假手术组、生理盐水组和Nec-1治疗组，每组各10只。脊髓损伤后7d对各组大鼠进行运动功能评价、运动诱发电位测定、脊髓坏死测定。结果 术后7d、14d、21d Nec-1治疗组大鼠运动功能恢复均好于生理盐水组，运动功能评分显著高于生理盐水组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。术后7d时，Nec-1治疗组大鼠MEP潜伏期变化为（71.37±12.71）%，显著低于生理盐水组[(104.5±14.57)%，t=8.147，P<0.01]，波幅峰值变化为（69.27±4.75）%，也显著小于生理盐水组[(87.93±5.47)%, t=3.201，P<0.05]。术后7d时，Nec-1治疗组脊髓损伤坏死区为（6.91±0.42）mm²，较生理盐水组脊髓损伤坏死区范围显著减小[(11.29±0.63) mm²，t=7.542，P<0.01）。术后7d时，Nec-1 治疗组存活神经元细胞计数为（10.54±1.27）个，较生理盐水组显著增多，差异有统计学意义[(5.27±0.47)个，t=6.341，P<0.01）；染色髓鞘IOD 相对值Nec-1治疗组为（0.94±0.06），较生理盐水组显著增多，差异有统计学意义[(0.67±0.08)，t=5.574，P<0.01）。结论 Nec-1可以改善大鼠运动功能及皮质运动诱发电位的恢复情况，对脊髓损伤修复具有促进作用。
【关键词】程序性坏死特异性抑制剂-1；脊髓损伤；修复
The protective role of Necrostain-1 in spinal cord injury in rats
【Abstract】 Objective To investigate the protective role of Necrostain-1 (Nec-1) in spinal cord injury in rats. Methods Rat spinal cord injury model was established according to the Allen’s method with some modification, and randomly divided into three groups: sham operated group, saline group and Nec-1 treatment group (n=10 per groups). The behavioral, evoked potential necrosis of spinal cord was measured 7d after injury. Results 7d, 14d and 21d after injury, the BBB score of Nec-1 treatment group were significantly higher than that of saline group (P<0.05), and similar to the sham group (P>0.05). 7d after injury, the latency of MEP of Nec-1 treatment group was (71.37±12.71) %, significantly lower than that of saline group [(104.5±14.57)%, t=8.147, P<0.01]. In addition, the latency of Nec-1 treatment group was (69.27±4.75) %, significantly lower than that of saline group [(87.93±5.47)%, t=3.201，P<0.05]. Moreover, the necrotic areas of injured spinal cord of Nec-1 treatment group were (6.91±0.42) mm², significantly lower than that of saline group [(11.29±0.63) mm², t=7.542, P<0.01]. The survival number of neurons of Nec-1 treatment group were (10.54±1.27), significantly higher than that of saline group [(5.27±0.47), t=6.341, P<0.01]. The relative IOD of myelin of Nec-1 treatment group were (0.94±0.06), significantly higher than that of saline group [(0.67±0.08), t=5.574, P<0.01]. Conclusions Nec-1 has a neuroprotective effect on spinal cord injury through promoting motor function and MEP recovery in rats.
【Keywords】Necrostain-1; Spinal cord injury; Recovery
 
脊髓损伤（SCI）是可逆性差、致残比例高的中枢神经系统损伤性疾病，研究表明急性期神经细胞的大量坏死和丢失是引起脊髓损伤的主要原因^[1]。Necrostain-1（Nec-1）是一种能够特异性抑制细胞程序性坏死（Necroptosis）的小分子生物碱类物质。研究表明应用Nec-1可以有效抑制细胞的坏死、减少心、胰腺、脑等实质器官的细胞死亡；减轻局部炎症反应和感染，进而降低组织损伤。Nec-1在心肌^[2]、脑^[3]、肾缺血^[4]再灌注损伤，创伤失血性休克^[5]等多种疾病中具有重要的保护作用，但其对于脊髓损伤的保护效果相关报道尚少。我们通过建立大鼠Nec-1模型，观察Nec-1对脊髓损伤修复的促进作用。
材料与方法

1. 材料：健康雄性SD大鼠30只，体重250-300g，由青海大学实验动物中心提供，饲养于室温和光照可控的饲养室内(18-20℃；每12h为光照、黑暗-循环)，自由进食水。Nec-1购自美国Enzo公司，NYU 打击器购自美国Stoelting公司，MP150多导电生理信号记录仪购自美国BIOPAC公司。
2. 大鼠脊髓损伤模型的建立：采用改良的Allen’s法建立大鼠脊髓损伤模型^[6]。腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/kg)麻醉后，将大鼠俯卧位固定于手术台上，背部脱毛并常规消毒后，以第10胸椎（T10）棘突为中心，沿脊柱方向作一1.5cm 长切口，逐层切开、分离各组织，显露T9-T11椎板。去除T10棘突，微型钳小心咬除T10椎板，T9椎板下缘及 T11 椎板上缘，显露脊髓。术中避免损伤硬脊膜、血管和神经根。脊髓显露面积约为3×3mm。固定夹固定T9和 T11的棘突后，置于脊柱撑开固定器，撑开固定，充分显露脊髓 T10节段。将其置NYU打击器上，打击能量为250g×mm，即将离 T10 硬脊膜表面25mm高处的10g重锤自由落下，撞击脊髓。致伤后快速收起重锤，可见对称分布的血肿形成，制伤过程中出现摆尾反射，躯体、双下肢的抽搐、痉挛扭动，说明造模成功。仔细止血，缝合。操作过程中严格无菌操作。实验过程中动物处置方法符合动物伦理学标准。术后给予青霉素(50000U/只），每日2 次，连续3天，预防感染；人工挤压膀胱辅助排尿，注意观察尿液颜色，是否浑浊及血尿等。观察切口处皮肤有无红肿、出血或感染等。保持笼内干燥清洁。
3. 实验分组：共建立大鼠脊髓损伤模型30只，随机分为3组，每组10只。（1）假手术组，手术操作与模型制备相同，但不用NYU打击器制T10脊髓钝挫伤；（2）Nec-1治疗组，大鼠于脊髓损伤造模后半小时用微量进样器予以鞘内注射20μl Nec-1(20mg/ml)；（3）生理盐水组，大鼠于脊髓损伤造模后半小时用微量进样器予以鞘内注射20μl 0.9% Nacl。
4. 大鼠运动功能评价：由3名非本实验组人员按照Basso Beattie Bresnahan （BBB）功能评分标准^[7]进行大鼠运动功能观察评分，将大鼠放在自制的开口木盒内（200×200×15cm）观察，每次观察5min。于脊髓损伤后 1d，3d，7d，14d，21d对各组大鼠进行评分。然后取平均值作为每次记录值。
5. 大鼠运动诱发电位检测：分别于造模前和造模后 1d、3d、7d 采用多导电生理信号记录仪 （ERS100C诱发电位放大器）进行皮层运动诱发电位（MEP）检测，操作在屏蔽室内进行，每次测试记录曲线超过3条，以保证测试结果的准确度和可靠度。信号经AcqKnowledge4.2 电生理图像分析系统进行图像分析，潜伏期为刺激开始到P1波离开基线的时间减去刺激延时（本实验刺激延时500ms）。波幅为P1波和N1 波电位绝对值之和。评价潜伏期及波幅时以术前测定值为标准(100%)，观察损伤后的变化情况，以消除个体间差异。
6. 大鼠脊髓坏死测定：造模后7d大鼠麻醉后，大鼠取仰卧位固定四肢及头部，剪开皮肤，划破纵膈，剪断两侧肋骨，掀起胸骨，暴露心脏，灌注针于心尖插入向上到达升主动脉，夹住固定，开始灌注，剪开右心耳。先用4℃0.9% Nacl 200ml快速灌洗体内循环血液，至右心耳流出清亮洗液。换用4℃多聚甲醛 200ml 灌注，至大鼠躯体僵硬。然后剔除脊柱背侧的软组织，暴露脊柱，用咬骨钳依次咬除棘突、椎板，充分显露脊髓，游离剪断两侧神经根，取出脊髓，以T10损伤区为中心，向头、尾两侧取材（1cm），分别行H&E染色和丽红春2R-亮绿染色。H&E染色切片于高倍镜下观察，将40 倍视野图像导入 ImageJ图像处理软件，在放大的图像上圈出坏死区的范围，测量计算损伤坏死区面积，损伤面积=选区总像素值/单位面积像素值×单位面积实际面积。丽红春-亮绿染色切片在200倍镜下选取视野，将图像导入 IPP6.0 图像处理软件，测量每张切片平均神经元数目和平均阳性染色髓鞘相对IOD值（用Nec-1组中样本的平均IOD值为标准1.0，以相对值观察各组的区别）。
7. 统计学方法：应用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料采用 表示，采用两样本t检验。

结 果

1. 各组大鼠运动功能比较：各组大鼠术前BBB评分均为21分，在术后7d、14d、21d Nec-1治疗组大鼠运动功能恢复均好于生理盐水组，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结果见表1。

表 1 各组大鼠术后不同时间点BBB评分比较（ ）

组别	术后1d	术后3d	术后7d	术后14d	术后21d
假手术组	18.27±0.28	19.59±0.24	21.00±0.00	21.00±0.00	21.00±0.00
生理 盐水组	0	1.79±0.28	3.12±0.32	6.17±0.41	7.84±0.97
Nec-1 治疗组	0	1.82±0.27	4.87±0.37*	10.48±1.08*	14.26±2.14 #

注：与生理盐水组比较，^*P<0.05， ^#P<0.01。

2. 各组大鼠神经电生理比较：各组大鼠术前均获得正常的MEP信号，波形稳定，波幅高，潜伏期短。在术后7d时，Nec-1治疗组大鼠MEP潜伏期变化显著低于生理盐水组（t=8.147，P<0.01），波幅峰值变化也显著小于生理盐水组（t=3.201，P<0.05）。结果见表2。

表 2 各组大鼠术后7d各组MEP潜伏期和波幅变化比较（ ）

组别	术后7d潜伏期变化（%）	术后7波幅变化（%）
假手术组	6.27±0.94	1.24±1.22
生理盐水组	104.5±14.57	87.93±5.47
Nec-1治疗组	71.37±12.71#	69.27±4.75*

注：与生理盐水组比较，^*P<0.05， ^#P<0.01。

3. 各组大鼠脊髓损伤坏死区面积比较：术后7d时，生理盐水组损伤中心区及周围区大量空洞形成，炎性细胞浸润，组织疏松，白质内神经纤维消失，少见出血；而 Nec-1治疗组损伤区组织较连续、结构较清晰，空洞减少，未见出血。Nec-1治疗组（6.91±0.42 mm²）较生理盐水组（11.29±0.63 mm²）脊髓损伤坏死区范围显著减小，坏死区域面积差异有统计学意义（t=7.542，P<0.01）。
4. 各组大鼠神经元细胞数及髓鞘IOD值比较：脊髓损伤7d后，生理盐水组白质中大量髓鞘变性，不着色，灰质内存活神经元较少，结构紊乱，可见囊腔样变化，表明 SCI 后大量神经纤维发生脱髓鞘改变，神经元细胞坏死，大量丢失；而 Nec-1治疗组白质内髓鞘着色区增加，灰质内存活神经元较 SCI组多、且形态较规则完整，结构排列较条理，囊腔样变性减轻。Nec-1 治疗组（10.54±1.27）存活神经元细胞计数较生理盐水组（5.27±0.47）显著增多，差异有统计学意义（t=6.341，P<0.01）；染色髓鞘IOD 相对值Nec-1治疗组（0.94±0.06）较生理盐水组（0.67±0.08）显著增多，差异有统计学意义（t=5.574，P<0.01）。

 
讨 论
在本研究中，我们采用改良Allen’s 法建立大鼠SCI模型，即采用NYU 打击器模拟SCI，能够较好的控制SCI的均一性和稳定性，建立可靠、稳定的大鼠 SCI模型，且造模死亡率低，为研究Nec-1对大鼠SCI的保护作用提供了良好的实验基础^[6]。首先，本研究检测了Nec-1在SCI后早期应用能否促进大鼠后肢运动功能的恢复。目前BBB评分是检测大鼠运动行为广泛采用的标准，其涵盖了大鼠后肢功能恢复过程中近乎全部的动作细节，与脊髓损伤程度高度相符^[7]。本研究参照BBB评分法，对损伤各组大鼠不同时间点的横向比较发现，SCI后大鼠后肢运动功能完全丧失，但随着时间的延长会逐渐缓慢恢复；纵向比较三组大鼠在不同时间点运动功能的恢复情况发现：在伤后1d，3d各组无明显区别，而在术后 7d、14d、21d，Nec-1组的BBB 评分均高于同时间点的假手术组和生理盐水组，尤其以术14d最为明显。所以从行为学分析来看，SCI 后早期应用 Nec-1对脊髓损伤运动功能恢复具有积极的治疗效果，这种疗效可能与其减轻了脊髓组织和神经细胞的损害，保留了更多的运动功能恢复的组织学基础有关。
MEP 与下肢的运动功能表现有显著的相关性，并且能够直接体现下行运动传导束的功能状态，是检测脊髓下行传导通路功能状态的可靠灵敏方法^[8]。因此，MEP 可作为SCI后评价功能状况和治疗效果的客观依据。潜伏期和波幅是它的主要观察指标。潜伏期主要反映神经通路的传导功能，而波幅主要反映动作电位的强度，当传导束受损时，表现为波幅降低、畸形，甚至消失。本研究结果显示：伤后 1d、3d损伤各组 MEP 所测波形均无明显的主反应，成近水平的规则波浪线。而在伤后7d损伤各组检测到主反应，其中生理盐水组波形低钝，潜伏期延长，峰峰值减小，而Nec-1组波形恢复相对明显，且潜伏期和峰峰值恢复程度较大。这些结果能较好的与行为学检测的结果相吻合，进一步说明脊髓损伤后早期应用 Nec-1的策略对脊髓损伤的修复有积极的治疗效果。
SCI后原、继发性损伤共同致使脊髓组织的病理变化：神经细胞的坏死丢失、神经纤维的脱髓鞘改变、大量炎症细胞浸润，进而引起神经运动功能的障碍^[9]。为了探讨 Nec-1能否改善SCI后损伤脊髓组织的病理变化，采用H&E染色方法进行比较观察，发现伤后 7d，Nec-1组较生理盐水组，坏死区范围减小，空洞形成减少，炎症细胞浸润减少，损伤区组织结构较连续，周围存活的神经元更多。表明 SCI后早期应用Nec-1治疗可以改善受损脊髓组织的一般病理变化。
为进一步探讨 Nec-1能否增多损伤脊髓中存活神经元的数目或减少神经元细胞的死亡，我们采用了丽春红2R-亮绿染色，其染色机制为髓鞘结构在酸性染液中带正电，呈碱性，与带负电的酸性染料如丽春红2R等结合，使其着色而被染成红色，灰质成浅绿色，神经元成绿色，而当其发生变性或退变后则不被着色^[10]。本研究中，脊髓损伤后7d，与SCI组相比 Nec-1 组存活的神经元增多，且形态相对完整，髓鞘破坏程度减轻，表明脊髓损伤后早期应用Nec-1可减轻 SCI 后髓鞘的破坏，减少神经元细胞的死亡或促进神经元细胞的存活，使残留神经元增多。这些形态学的结果进一步验证了行为学和电生理结果的可信性。
本研究结果表明，Nec-1可以从多个途径改善大鼠运动功能及皮质运动诱发电位的恢复情，对脊髓损伤修复具有很好的促进作用，但是Nec-1保护SCI的确切分子机制有待进一步研究。
参考文献
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