研究方法
    1.单个核细胞分离：取骨髓液5ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，1×PBS洗涤2次，甩干，-80℃冻存。
    2. RNA的提取及逆转录：应用RNA提取试剂盒mirVana^TM miRNA Iso Kit进行单个核细胞RNA的提取，提取过程完全按照试剂盒操作指南进行。本研究所提总RNA A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.9－2.0之间，RNA纯度好。①取2μgRNA以M-MLV及随机引物进行逆转录反应合成cDNA，作为EZH2基因检测用；②应用Taqman microRNA RT Kit 、microRNA-101及内对照RNU6-1逆转录引物将每例标本的RNA（每个microRNA 应用10ng）逆转录为cDNA，逆转录过程完全按照试剂盒操作指南进行。所得cDNA用灭菌双蒸水按1：10的比例稀释后置于－20℃冰箱冻存备用作为microRNA-101检测用。
    3. MicroRNA的相对定量检测：采用TaqMan探针法进行microRNA-101的相对定量检测。以RNU6-1做为内对照，校正器选用Namalwa 细胞系，反应体系20ul（参照ABI公司MicroRNA表达检测指南）。microRNA-101 的上游引物为 5’-TGGGCTACAGTACTGTGATA-3’ ,下游引物为5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’. RNU6-1的上游引物为5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物为5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’;每例标本的目的基因均同时做复孔以减少误差。扩增热循环条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 。PCR结果采用2^-△△Ct法进行分析。
    4. EZH2基因表达的相对定量检测：EZH2（基因编号：2146）基因PCR扩增上游引物5’-GACCCTGACCTCTGTCTTACTT-3’，下游引物5’-GATGGTGCCAGCAATAGATG-3’。对照基因为GAPDH，上游引物5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物为5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。每个反应均设2个复孔，PCR 反应条件为: 95℃5分钟， 95℃，10秒， 56℃ ，20秒 和72℃ ，20秒，共40个循环。
    5.免疫组织化学检测EZH2蛋白表达：采用免疫组织化学SABC法，各步骤按说明书进行，以微波枸橼盐进行抗原修复，DAB显色，同时用PBS代替一抗作为染色的阴性对照，用已知前列腺癌阳性切片作阳性对照．兔抗人EZH2单克隆抗体购于美国Invitrogen公司，DAB显色试剂盒、免疫组织化学染色体试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。按半定量积分法判定EZH2蛋白表达结果：细胞阳性染色为细胞质内出现黄色、棕黄色、棕褐色颗粒．阳性细胞率：镜下随机选择10个高倍镜视野的1000个肿瘤细胞，计算一个高倍镜视野的阳性细胞的平均百分率，阳性细胞≤25％为0分、26％-50％为1分、51％-75％为2分、>75％为3分；阳性染色强度：无色为0分、黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分．将细胞阳性率和阳性染色强度两者的积分相乘：0分为阴性(-)，1和2分为弱阳性(+)，3和4分为中度阳性(++)，6和9分为强阳性(+++)。