【摘要】 目的：探讨研究血清反应因子（Serum response factor, SRF）、锌指转录因子Slug和E-钙粘蛋白（E-cadherin）在非小细胞肺癌（no-small cell lung cancers, NSCLC）中表达及其临床意义。方法：采用免疫组织化学染色法检测47例NSCLC组织中SRF、Slug和E-cadherin蛋白的表达情况。结果：SRF、Slug的阳性表达和E-cadherin的异位/缺失表达在NSCLC组织中阳性表达率分别为57.45%（27/47）、68.09%（37/47）和78.72%（37/47），显著高于癌旁组织的10.64%、23.40%和25.53%，差异均具有统计学意义（P>0.05）。其中SRF蛋白表达与NSCLC分化程度、临床分期密切相关（P<0.05）；Slug蛋白表达与NSCLC分化程度、临床分期和有无淋巴结转移密切相关；有74.07%（20/27）SRF阳性表达同时伴有E-cadherin的异位表达（P<0.05）；而有96.88%（31/32）Slug阳性表达同时伴有E-cadherin的异位表达，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：SRF、Slug的阳性表达和E-cadherin的异位/缺失表达对促进NSCLC发生、发展具有重要意义，可能是NSCLC发生上皮-间质转化的重要机制之一。
【关键词】肺肿瘤；SRF；Slug；E-cadherin；免疫组织化学
 
【中图分类号】R734.2  【文献标识码】A  【文章编号】
 
Li Yan, Li Xin, Wu Aiping, Zhang Lei, Zhou Haiying, Lv Zheng, Gao Yang, Ren Shuhua
 
1Department of chest surgery, Tangshan people’s hospital; 2 Department of neurology, Tangshan people’s hospital;  3 College of Basic Medicine, Hebei United University; Heibei Tangshan 063000
 
[ABSTRACT] OBJECTIVE: To explore the expression and clinical significance of serum response factor (SRF), Slug and E-cadherin in non-small cell lung cancer (NSCLC). METHODS: The expression of SRF, Slug and E-cadherin protein were measured by immunohistochemistry assay. RESULTS: The positive rate of SRF, Slug and E-cadherin in NSCLC group were 57.45% (27/47), 68.09% (37/47) and 78.72% (37/47), which shows significant difference from those of control group which is 10.64%, 23.40% and 25.53%, respectively (P<0.05). The positive expression of SRF was correlated with differentiation and clinical stage (P<0.05). The expression of Slug was related to differentiation, clinical stage and lymph node metastasis(P<0.05). In 47 case NSCLCs, the co-positive rates of E-acdherin with SRF and Slug were 74.07% and 96.88% but the positive correlation had no significant difference through spearman’s and χ² test (P>0.05). CONCLUSIONS: The up-regulation of SRF, Slug and loss membrane expression of E-cadherin may play critical roles in the occurrence and development of NSCLC, with related to the action of epithelial-mesenchymaltransition (EMT).
[KEYWORDS] NSCLC;serum response factor; Slug; E-acdherin;  Immuohistochemical staining

 
肺癌是常见的恶性肿瘤，发病率及死亡率高，其中70%-80%的肺癌是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），而70%以上的NSCLC患者确诊时已经失去了手术机会，即使辅以放、化疗等综合治疗仍不能显著提高肺癌的生存率。虽然目前NSCLC发生机制仍未完全阐明，但是目前公认肿瘤细胞获得侵袭和转移的能力是肿瘤患者生存率低的细胞分子基础。而目前研究发现，在生长发育、损伤修复和器官纤维化等生理和病理过程中发生的上皮-间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）被认为是肿瘤侵袭和转移的重要步骤和机制之一^[1]。血清应答因子（serum response factor, SRF）是一类重要的核转录因子，在多种肿瘤组织中高表达，体外实验显示高表达SRF能够促进肿瘤细胞侵获得间质表型，即获得迁移的能力，其侵袭性增高，被认为是上皮-间质转化的重要调控因子^[2]。Slug属于Snail家族的锌指蛋白转录因子，是EMT的重要调控因子。诸多研究发现在白血病、骨肉瘤、食管癌以及乳腺癌中，Slug的阳性表达与E-cadherin表达下调密切相关^[3]。E-cadherin涉及调控细胞间粘附作用，在肿瘤侵袭和转移中起到抑制作用。E-cadherin胞内结构域能够被胞浆内α、β-连环蛋白（catenin）介导与肌动蛋白结合，其复合物在肿瘤中涉及调控肿瘤细胞的去分化、侵袭和转移^[4]。本研究联合检测SRF、Slug和E-cadherin的表达，分析其临床病理学意义，为研究NSCLC发生、发展机制，选择合适的治疗靶点提供一定的实验基础和理论依据。
1 材料与方法
1.1 临床标本
收集2008年6月-2012年6月期间在唐山市工人医学院胸外科进行手术切除并经病理诊断证实的NSCLC标本47例，所有患者临床资料完整，均为肺癌原发病灶，无其他肿瘤病史；术前均未接受放、化疗治疗；无肝炎、肝硬化、自身免疫性疾病或其他严重的基础疾病。以肿瘤组织石蜡标本作为实验组，挑选47例同例患者的癌周肺组织石蜡标本作为对照组（镜下无癌细胞浸润及转移），所有标本采用10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm切片，由唐山市工人医院病理科诊断、存档并提供。其中男性33例，女性14例，年龄43-65岁（中位年龄54岁），其中≥50岁 30例，<50岁 17例；肿瘤直径> 3 cm 25例，≤ 3 cm为22例；鳞癌27例，腺癌14例，腺鳞癌6例；高分化癌7例，中分化癌27例，低分化13例；根据UICC的肺癌临床分期标准，其中I期20例、II期11例、III期16例；有淋巴结转移26例，无淋巴结转移21例；有吸烟29例，无吸烟18例。
1.2 主要试剂和方法
SRF抗体（sc-335，美国Santa Cruz公司）、Slug抗体（sc-166476，美国Santa Cruz公司）、E-cadherin抗体（MAB-0589，福州迈新）；免疫组化试剂盒（SP-9001、9002）、DAB显色液均购置于北京中杉金桥。实验方法按说明书进行，每次实验均以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定
SRF、Slug表达定位于细胞核，在胞浆内也有表达呈棕黄色或棕褐色。以其高倍视野下随机选取5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分比，按照以下4级进行计分：0分：阳性细胞数<10%；1分：10%-25%；2分：26%-50%；3分：51%-75%；4分：>75%。染色强度评分标准：无色0分；淡黄色1分；棕黄色2分；棕色或棕褐色3分。以两者乘积作为阳性评判标准，其中4分以上定义为阳性。E-cadherin蛋白阳性染色主要定位于细胞膜，于肿瘤细胞质或细胞核表达≥10%，称为异位表达；不表达或细胞膜表达＜10%称为细胞膜表达缺失；异位表达和细胞膜表达缺失统称为阳性表达，单纯细胞膜定义表达为阴性表达^[2-4]。
1.4 统计学处理
用SPSS13.0进行统计分析。不同组别间SRF、Slug和E-cadherin表达水平的比较采用χ²检验，SRF、Slug与E-cadherin之间相关性分析采用spearman相关系数法，以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 SRF、Slug和E-cadherin蛋白的表达
SRF、Slug的阳性表达和E-cadherin的异位/缺失表达在NSCLC组织中阳性表达率分别为57.45%（27/47）、68.09%（37/47）和78.72%（37/47），显著高于癌旁组织的10.64%、23.40%和25.53%，差异均具有统计学意义（P>0.05）。见图1
2.2 SRF、Slug和E-cadherin蛋白的表达的临床意义
如表1所示，SRF蛋白在NSCLC中的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、淋巴结转移和吸烟等因素无关（P>0.05）。随着分化程度增加，SRF表达逐渐上调，在高+中分化组NSCLC中阳性表达率为47.06%（16/34），显著低于低分化组NSCLC的84.62%（11/13），差异具有统计学意义（P<0.05）；在31例I+II期 NSCLC中阳性表达14例，阳性表达率为45.16%，显著低于III期NSCLC组中的81.25%（13/16），差异具有统计学意义（P<0.05）。Slug在低分化NSCLC组中阳性表达率为92.31%（12/13），显著高于高+中分化组的58.82%（20/34），差异具有统计学意义（P<0.05）；在III期NSCLC中阳性表达率为87.50%（14/16），显著高于临床分期I+II期NSCLC中阳性表达率为58.06%（18/31），差异具有统计学意义（P<0.05）；而在有淋巴结转移组中Slug阳性表达率为73.08%（19/26），显著高于无淋巴结转移组的61.90%（13/21），差异具有统计学意义（P<0.05）。E-cadherin在NSCLC中的表达，与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、临床病理分期和淋巴结转移和吸烟等因素无关（P>0.05）。
2.3 SRF、Slug与E-cadherin蛋白表达的相关性分析
如表2所示，有74.07%（20/27）SRF阳性表达同时伴有E-cadherin的异位表达；而有96.88%（31/32）Slug阳性表达同时伴有E-cadherin的异位表达，但经统计学分析这种相关性无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
E-cadherin属于cadherin家族的钙离子依赖性的细胞粘附因子，正常时表达于细胞膜，与β-catenin形成蛋白复合物，在维持上皮极性和完整性方面发挥了重要的调节作用。研究表明E-cadherin的异位表达和缺失表达是多种肿瘤较为灵敏的重要指标，与肿瘤发生、发展、浸润和迁移密切相关，也是EMT的重要标志之一^[4,5]。SRF是属于MADS盒家族的一类转录因子，其能够与超过60个辅因子结合，形成蛋白复合物来控制依赖于CarG-box的DNA转录。近些年来研究发现，SRF在多种肿瘤组织中高表达，如肠癌、胃癌、食管癌、肝癌和甲状腺癌等，且与分化程度、浸润深度、淋巴结转移密切相关，其高表达多提示肿瘤侵袭和转移能力的提高，可能涉及E-cadherin/β-catenin 异位表达与失衡，以及MMP蛋白表达的上调；体外研究多发现上调SRF的表达，能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力，并表达间质表型（如波形蛋白）；相反抑制SRF的表达，能够阻滞其细胞周期，transwell和划痕实验显示肿瘤细胞侵袭和转移的能力下降^[6-9]。Slug蛋白属于锌指蛋白类转录因子Snail家族，其其C端结构域高度保守，包含4-6个C₂H₂样的锌指结构。这些锌指结构序列特异性的与DNA E-盒（E-box）（5’-CAGGTG-3’）结合；而在N端末端包含一个进化上高度保守的SNAG结构域，能够与转录辅因子结合，招募组蛋白脱乙酰酶形成蛋白复合物，发挥抑制靶基因转录的作用^[10]。体内外研究发现Slug半衰期较短，可被糖原合成激酶（glycogen synthase kinase, GSK）-3β磷酸化介导的泛素化降解，在细胞运动、侵袭、转移、细胞周期调控以及放化疗耐药发挥了重要的调控作用，是EMT重要的标记蛋白之一。在多种肿瘤组织中，包括食管癌、肝癌、肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和脑胶质瘤中，Slug的过表达与E-cadherin表达下调、低分化、淋巴结转移、术后复发、生存率低密切相关；体外研究亦发现过表达Slug能够诱导肿瘤细胞发生EMT，使肿瘤细胞获得间质表型和肿瘤干细胞表型^[11-13]。已有文献表明Slug作为一种转录抑制因子，能够结合到E-cadherin启动子上抑制其转录，提示Slug能够通过抑制E-cadherin等上皮标记物的表达，促进肿瘤细胞发生EMT^[14]。而E-cadherin的异位表达，能够促进β-catenin的浆转位与GSK-3β结合，能够稳定SRF转录辅因子（MRTF-A）的目的，促进SRF的核转位，诱导靶基因的转录（如间质标记物vimentin和平滑肌肌动蛋白表达的上调），从而促进EMT的发生^[15]。
本研究结果显示，SRF、Slug和E-cadherin蛋白在NSCLC组织中的差异表达，提示其能够在NSCLC发生、发展中起到关键的调控作用。其中SRF、Slug蛋白在NSCLC组织中高表达与分化程度、临床分期和淋巴结转移密切相关，提示二者的高表达与NSCLC侵袭和转移关系较为紧密。而二者与E-cadherin的关系，虽无统计学意义，但综合国内外文献，亦提示SRF、Slug与E-cadherin的异常表达关系密切，可能共同参与EMT的形成，促进NSCLC的发生、发展。

 
参考文献
 

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A

B

C

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A: SRF在NSCL中阳性表达，主要定位于细胞核，胞浆部分表达，呈棕黄色颗粒；B：Slug在NSCLC中阳性表达，主要定位于细胞核，亦可见胞浆表达，呈棕黄色颗粒；C：E-cadherin在NSCLC中膜表达缺失 （×200）
 
图1 SRF、Slug和E-cadherin在NSCLC组织中的表达

表 1 SRF、Slug和E-cadherin在NSCLC中表达的临床意义

Clinical significance	n	SRF				Slug				E-cadherin
		+	χ2	P		+	χ2	P		+	χ2	P
Sex
Male	33	18				24				27
Female	14	9	0.381	0.537		8	0.499	0.480		10	0.378	0.539
Age
≥50 y	30	16				19				23
<50 y	17	11	0.574	0.449		13	0.862	0.353		14	0.008	0.931
Size of tumor
≤3 cm	25	12				15				14
>3 cm	22	15	1.950	0.163		17	1.607	0.205		13	0.046	0.831
Histologic type
squamous	27	16				18				14
adencocarcinoma	14	7				11				9
Adeno-squamous	6	4	0.564	0.754		3	1.628	0.443		4	0.829	0.661
Differentiated
Well+ moderately	34	16				20				25
poorly	13	11	5.426	0.020		12	4.852	0.028		12	1.107	0.313
Pathological grade
I+II	31	14				18				22
III	16	13	5.622	0.018		14	5.640	0.018		15	2.051	0.152
Lymph Node Metastasis
+	26	12				14				18
-	21	15	3.036	0.081		18	5.430	0.020		19	1.991	0.158
Smoking status
+	29	19				22				23
-	18	6	0.007	0.936		10	2.108	0.147		14	0.000	1.000

 
表2 SRF、Slug与E-cadherin在NSCLC中表达的相关性分析

E-cadherin	SRF					Slug
	+	-	r	P		+	-	r	P
+	20	17	0.132	0.138		31	6	0.536	0.133
-	7	3				1	9