[摘要] 目的 研究雌激素在甲状腺癌肿瘤微环境中对内皮细胞的促血管生成作用以及与VEGF受体的关系。方法 免疫荧光检测雌激素受体（ER）在甲状腺癌细胞中的表达；检测雌二醇（E₂）在有/无其雌激素受体抑制剂氟维司群（fulvestrant）时处理乳头状甲状腺癌细胞（BCPAP）以及滤泡性甲状腺癌细胞（ML-1）的培养基对人脐静脉细胞（HUVECs）管腔形成和迁移的影响，并进一步研究了E₂对VEGF分泌的影响以及VEGF在雌激素作用于内皮细胞中的机制。结果 BCPAP细胞均有ERα和ERβ的表达；经E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均可以诱导HUVECs管腔的形成，且在加入雌激素受体的拮抗剂后管腔形成显著降低；E₂可以显著增加ML-1细胞VEGF的含量，而在加入fulvestrant后其增加作用被抑制；在无VEGF中和性抗体的情况下，E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均可以诱导HUVECs的迁移和管腔形成，且这种作用可以被fulvestrant抑制。但是在有VEGF中和性抗体的情况下，E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均没有诱导迁移和管腔形成的作用。 结论 雌激素通过激活甲状腺癌细胞的雌激素受体使VEGF表达增加，从而加速了内皮细胞的迁移和管腔形成。
[关键词]  雌激素；甲状腺癌；血管生成；血管内皮生长因子
Angiogenesis effects of estrogen in thyroid cancer by generation of VEGF
GUO Xin¹, WU Zhi-yu², CHEN Chun-you¹
(Tangshan Gongren Hospital, 1Department of head and neck surgery 2 Department of general surgery and endoscopy, Tangshan Hebei 063000)
[Abstract] Objective To explore the induction of a proangiogenic phenotype in ndothelial cells in the thyroid tumormicroenvironment by estrogen-treated thyroid cancer cells and to define the role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in this interaction. Methods Immunofluorescence was used to confirm the presence of ER and ER in thyroid cancer cells. Thyroid tumor cell lines BCPAP (papillary thyroid cancer) and ML-1 (follicular thyroid cancer) were cultured with estradiol with and without an estrogen receptor (ER) inhibitor (fulvestrant) and used to treat human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Conditioned medium was then used to evaluate the induction of HUVEC tubulogenesis and migration. Secretion of VEGF in this medium was evaluated by Western blot analysis. The subsequent effects of an ER inhibitor (fulvestrant) and a neutralizing VEGF antibody were also observed. Results Estrogen receptor and ER are expressed in thyroid cancer cells. Estrogen-stimulated ML-1 cells secreted an increased amount of VEGF likely as a result of ER signaling. In contact with this environment, HUVECs demonstrate enhanced tubulogenesis and migration. Western blot analysis documented estrogen-mediated up-regulation of PI3K in HUVECs. These effects were mitigated by an ER inhibitor (fulvestrant/ICI) and a neutralizing VEGF antibody. Conclusions Our data provide evidence that estrogen can induce a proangiogenic endothelial cell phenotype in the thyroid tumormicroenvironment through ER and VEGF signaling.
 
[Key words]  Estrogen; Thyroid cancer; Angiogenes; VEGF
有资料表明^[1]，甲状腺癌的女性患者是男性的3-4倍，实际上，女性患者出现甲状腺疾病的概率也达到了一个很高的水平，基本上达到了乳腺癌的发病率^[2]。甲状腺癌在女性怀孕以及绝经早期的危险性会更大，而绝经后的危险性则降低。流行病学的证据显示^[3]，雌激素可以通过其受体在甲状腺增殖性疾病中发挥重要的作用。前期研究结果表明，雌激素可以增强甲状腺癌细胞的促有丝分裂，迁移以及侵袭性。而且这些血管生成过程是由肿瘤细胞与内皮细胞的旁分泌信号通路引起的。骨髓源性内皮祖细胞就是一类表达雌激素受体且可以与肿瘤细胞相互作用引起新生血管的生成的细胞。
当肿瘤体积大于2mm时，肿瘤细胞需要血管生成提供必要的养分如氧，蛋白水解酶类，激素等等。血管生成在肿瘤微环境中受到促血管生成以及抗血管生成物质的调节处于一种平衡的状态，最重要的促血管生成物质是VEGF（血管内皮生长因子），激活VEGF受体后也会激活下游酪氨酸激酶的活性，导致内皮细胞迁移、管腔生成。VEGF在甲状腺癌中起着重要的作用，甲状腺癌细胞系释放的VEGF显著高于正常的甲状腺细胞^[4]。根据上述论据，我们推断雌激素在甲状腺癌中具有促进肿瘤血管生成的作用，从而表现出女性患者的高危性。因此，本次研究即在肿瘤微环境中研究VEGF对于血管生成的作用，并探求其引起血管生成的作用的机制。
 
研究方法
1细胞培养：人乳头状甲状腺癌细胞（BCPAP）和人滤泡性甲状腺癌细胞（ML-1）均购自北京康碧泉生物科技有限公司，使用含10%FBS的RPMI-1640培养基进行培养，人脐静脉内皮细胞 HUVEC 购于南京凯基生物有限公司，用含 10%胎牛血清DMEM 的培养基培养，待细胞处于对数生长期时收集实验。所有细胞均置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
 
2免疫荧光检测雌激素受体的表达^[5]：将BCPAP细胞以15000/孔的密度铺于载玻片，37℃过夜，放入4%多聚甲醛，再加入0.2%的Triton-X-100，再使用含0.1%的Triton-X-100,1%的牛血清白蛋白以及10%的羊血清的封闭液进行封闭。按1:600加入雌激素受体α（ERα）和雌激素受体β（ERβ）的抗体，4℃过夜，PBS漂洗后使用荧光二抗（1:500）避光孵育1h，PBS漂洗，再使用DAPI进行染色5min，PBS漂洗后上荧光显微镜进行拍照。
 
3内皮细胞管腔形成实验：我们分别首先研究了10^-8M的雌二醇（E₂）以及10^-8M的E₂混合10^-5M的雌激素受体抑制剂氟维司群(fulvestrant)处理后的BCPAP细胞和ML-1细胞培养基对于HUVECs细胞的管腔形成的影响。并进一步研究了在有/无VEGF中和性抗体的情况下10^-8M的E₂以及10^-8M的E₂混合10^-5M的雌激素受体抑制剂fulvestrant处理后的BCPAP细胞和ML-1细胞培养基对于HUVECs细胞的管腔形成的影响。首先将预冷的96孔板中加入50µl/孔的Matrigel，37^ｏC放置1h使其凝固。取生长状态良好的有/无10^-8M VEGF中和性抗体的HUVEC细胞，每孔加入180µl的HUVECs细胞悬液(密度为1.5´10⁴个细胞/孔)，分别加入10^-8M E₂， 10^-8M+10^-5M fulvestrant，PBS作为阴性对照，37^ｏC孵育8h，显微镜下观察管腔形成情况并拍照，每组实验重复5孔^[6]。
 
4内皮细胞迁移实验：我们研究了在有/无VEGF中和性抗体的情况下10^-8M的E₂以及10^-8M的E₂混合10^-5M的E₂的抑制剂fulvestrant处理后的BCPAP细胞和ML-1细胞培养基对于HUVECs细胞迁移的影响。将Transwell小室悬挂于24孔板中。该装置分内外两室，内室底部为多聚碳酸盐滤膜(孔径8µm)。取有/无10^-8M VEGF中和性抗体的HUVEC细胞，计数1.5´10⁴个细胞/100µl，将混匀的细胞悬液90µl注入内室，分别加入10^-8M E₂， 10^-8M+10^-5M fulvestrant，PBS作为阴性对照，外室则加入含10%胎牛血清的DMEM培养基600μl。37^ＯC孵育6 h后，弃去孔中培养液，用4%多聚甲醛固定细胞10 min。用棉签轻轻擦去内室上层未迁移的细胞，0.1%结晶紫常温染色10 min，用PBS漂净多余染料，将膜外侧面置于显微镜下拍照，随机选取5个视野，计算视野内细胞数目，取平均值，每组实验重复5孔^[7]。
 
5雌二醇（E₂）诱导ML-1细胞分泌VEGF含量的测定：采用western blot法^[8]，在ML-1细胞中分别加入PBS，10^-8M E₂以及10^-8M E₂+10^-5M fulvestrant，RIPA 提取液于冰上裂解对数生长期细胞提取蛋白 ，BCA法测上清蛋白浓度，样品与2×loading buffer 等体积混匀，98^ｏC 变性5分钟，上样，每孔总蛋白量约为30μg。80V浓缩胶 30分钟，120V分离胶，2小时。 取下胶，按尺寸剪取合适大小的 Whatmann 滤纸及硝酸纤维素膜，上下各三层滤纸，中间为胶和膜，胶在负极，膜在阳极，用玻棒仔细赶除气泡，采用半干式转膜，恒流 75mA，转膜60min。转膜结束后，取下石墨板，以转膜液清洗硝酸纤维素膜，对比预染 Marker蓝色条带剪切。将剪切好的硝酸纤维素膜浸入立春红工作液中，染色 2~5分钟后，蒸馏水冲洗，观察转膜效率，用 PBST 洗去立春红条带。 在6cm 培养皿中加入新鲜配制的封闭液（需至少搅拌0.5h），搅拌均匀，将NC膜完全浸入，平放于摇床上，37^ｏC 温育1h。封闭结束后，弃封闭液，用少量 PBST 将残余奶粉漂洗干净，加入VEGF一抗，置于4^ｏC过夜。将整条膜置于皿中用 PBST 清洗3 次，10min/次。 用 PBST 稀释辣根过氧化酶标记的二抗至工作液浓度（1:2000），37^ｏC恒温摇床反应1h。 反应结束后用 PBST 清洗三次，10min/次。新鲜配制发光液。PIERCE 发光液反应 10min，将膜转移至暗匣中。进暗室曝光显影。胶片用自来水冲洗晾干，于全自动凝胶成像分析系统进行分析，使用Quality one 软件对条带灰度进行分析。
 
6统计方法：使用SPSS18.0软件进行统计分析，组间数据的比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示结果有显著性差异。
 
研究结果：
1雌激素受体（ER）在甲状腺癌细胞BCPAP上的表达：从结果可以看出，ERα和ERβ在BCPAP细胞上均有阳性表达，合并后与DAPI染出的细胞核的颜色也可以重合，表明在BCPAP细胞上有ERα和ERαβ的表达。（见图1）
 
2 雌二醇处理的BCPAP细胞和ML-1细胞分泌液诱导内皮细胞管腔形成的作用：从图2可以看出，经E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均可以诱导HUVECs管腔的形成，且在加入雌激素受体的拮抗剂后管腔形成显著降低，表明E₂可以通过激活BAPAP细胞和ML-1细胞雌激素受体分泌诱导管腔生成的因子。
 
3雌二醇诱导ML-1细胞分泌VEGF的研究：从结果可以看出，E₂可以显著增加ML-1细胞VEGF的含量，而在加入fulvestrant后其增加作用被抑制，表明E₂可以通过激活ML-1细胞雌激素受体产生VEGF。（见图3）
 
4 E₂及E₂+fulvestrant处理的BCPAP细胞（A）和ML-1细胞（B）培养基对有无VEGF中和性抗体的HUVEC细胞迁移的影响：从图4可以看出，在无VEGF中和性抗体的情况下，E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均可以诱导HUVECs的迁移，且这种作用可以被fulvestrant抑制。但是在有VEGF中和性抗体的情况下，E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均没有明显的诱导迁移的作用，表明雌激素诱导内皮细胞迁移的作用是通过分泌VEGF。
 
5 E₂及E₂+fulvestrant处理的BCPAP细胞（A）和ML-1细胞（B）培养基对有无VEGF中和性抗体的HUVEC细胞管腔形成的影响：从图5可以看出，在无VEGF中和性抗体的情况下，E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均可以诱导HUVECs的管腔形成，且这种作用可以被fulvestrant抑制。但是在有VEGF中和性抗体的情况下，E₂处理的BCPAP细胞和ML-1细胞的培养基均没有明显的诱导管腔形成的作用，表明雌激素诱导内皮细胞管腔形成的作用是通过分泌VEGF。

图1 雌激素受体（ER）α和β在甲状腺癌细胞BCPAP上的表达。左上为受体表达，右上为DAPI染色，左下为普通显微图，右下为合并图。
 

图2 E₂诱导BCPAP细胞和ML-1细胞内皮细胞管腔形成的作用
 
 

图3 E₂诱导ML-1细胞分泌VEGF的含量，*，与对照组相比P＜0.05。

图4 E₂及E₂+fulvestrant处理的BCPAP细胞（A）和ML-1细胞（B）培养基对有无VEGF中和性抗体的HUVEC细胞迁移的影响，*，与对照组相比P＜0.05。
 

图5 E₂及E₂+fulvestrant处理的BCPAP细胞（A）和ML-1细胞（B）培养基对有无VEGF中和性抗体情况下的HUVEC细胞管腔形成的影响
 
讨论
雌激素对分化的甲状腺癌的增殖具有重要的作用，雌激素也可通过自身的受体调节甲状腺细胞的增殖，粘附和迁移^[9]。对于超过2mm的实体瘤，甲状腺肿瘤的微环境将会引起血管生成。本次研究表明，甲状腺癌细胞有雌激素受体的表达，而且雌激素也可以刺激肿瘤细胞旁分泌因子促进内皮细胞的迁移和管腔形成。雌激素的上述作用也可以被其受体拮抗剂所抑制，表明雌激素通过雌激素受体产生上述作用。进一步的实验也表明，雌激素可以刺激甲状腺癌细胞分泌VEGF，且这种作用也可以被雌激素受体所拮抗。使用VEGF的中和性抗体也可以抑制内皮细胞的迁移和管腔形成，这些证据可以表明，雌激素可以通过激活甲状腺癌细胞的雌激素受体产生VEGF，从而使内皮细胞出现迁移和管腔形成，导致血管生成。
VEGF的表达在分化的甲状腺癌中的表达已有报道^[10]，正常甲状腺与分化的甲状腺癌均有基础水平的VEGF的表达。刺激甲状腺的激素在各种细胞系中均可以刺激VEGF的分泌，而甲状腺癌细胞在这些激素刺激后的VEGF分泌量会更高^[11]。之后的研究表明^[12]，分化的甲状腺癌细胞的VEGF的mRNA和蛋白水平均高于正常的甲状腺细胞。在接种滤泡性甲状腺癌的裸鼠，注射不同剂量重组的VEGF蛋白后，血管数与肿瘤体积均有增加，且与VEGF呈剂量依赖性，同时，注射VEGF中和性抗体的裸鼠的血管数与肿瘤体积均有减少，表明VEGF对甲状腺癌肿瘤血管生成及肿瘤体积具有促进作用^[13]。
从本次研究的结果可以看出，雌激素本身可以通过激活甲状腺癌细胞上的雌激素受体使其VEGF的分泌增加，导致了血管生成物质的失衡，使得内皮细胞的迁移和管腔形成能力增强，朝向血管生成的方向发展，这进一步佐证了临床女性甲状腺癌患者的危害较高的数据，为甲状腺癌的治疗提供了一个新的思路。
 
 
参考文献
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