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研究Claudin-1蛋白在甲状腺癌中的表达
摘要 目的：研究Claudin-1蛋白在甲状腺癌中的表达。方法：选取27例乳头状甲状腺癌及其淋巴结转移组织、17例滤泡性甲状腺癌以及19例滤泡性腺癌患者的肿瘤组织，使用免疫组织化学方法检测Claudin-1蛋白的表达，并检测Claudin-1蛋白调控通路中β-catenin的表达。结果：乳头状甲状腺癌组织及淋巴结转移中均有Claudin-1蛋白的高表达，滤泡性甲状腺癌以及滤泡性腺癌患者的肿瘤组织中Claudin-1蛋白的表达较低。β-catenin的表达与Claudin-1蛋白的表达基本一致，甲状腺癌中Claudin-1蛋白的表达主要受wnt/β-catenin途径进行调控。结论：Claudin-1蛋白在甲状腺癌不同类型中有不同的表达，是甲状腺肿瘤的一个重要标志物，其产生受wnt/β-catenin途径进行调控。
关键词 甲状腺癌；免疫组化；Claudin-1；β-catenin
Expression and regulation of claudin-1 protein in thyroid carcinoma
GUO Xin1, WU Zhi-yu2, CHEN Chun-you1
(Tangshan Gongren Hospital, 1Department of head and neck surgery 2 Department of general surgery and endoscopy, Tangshan Hebei 063000)
Abstract: Objective: To determine the pattern of claudin-1 expression in various types of thyroid lesions at the protein level and investigating the immunolocalization of β-catenin reported to regulate claudin-1 expression. Methods: Tweenty-seven cases of papillary thyroid carcinoma patients, 17 follicular thyroid carcinomas patients and 19 follicular adenomas patients were evaluated by quantitative immunohistochemistry in claudin-1 and β-catenin expression. Results: All cases Conspicuous claudin-1 immunostaining was detected in the majority of papillary thyroid carcinoma and lymph node metastases (19/27 and 9/10, respectively). On the other hand, we found weak or no claudin-1 expression in any of the follicular thyroid carcinomas and follicular adenomas cases. Conclusion: Our data prove that high claudin-1 protein expression is a important marker of thyroid cancer, and the generation of claudin-1 is regulated by wnt/β-catenin pathway in thyroid tumors.
Key words Thyroid cancer; Immunohistochemical; Claudin-1; β-catenin
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤之一，约占恶性肿瘤发生率的1%，绝大多数甲状腺瘤源于滤泡上皮[1]。源于滤泡上皮的肿瘤根据组织和临床特征可以分为低分化型，中等分化型以及高分化型。其中高分化型主要包括乳头状甲状腺癌和滤泡性甲状腺癌。乳头状甲状腺癌是最常见的甲状腺癌，约占甲状腺上皮肿瘤的80%，而更具侵袭性的滤泡性甲状腺癌所占比例却较低[2]。致瘤性转化是一种多步骤的包括一系列分子和形态学的改变，使组织由正常状态转移至稳定的肿瘤状态。Claudin蛋白是一类跨膜蛋白家族，是紧密接头的主要组成部分，Claudin-1是最早被发现的，至今已有24种Claudin蛋白被发现，其致癌作用也在很多肿瘤中被阐明[3]。不同的Claudin蛋白表达在各种癌症包括宫颈癌，结直肠癌，胰脏癌以及肾癌中有表达。而且Claudin蛋白在正常组织中的表达与肿瘤组织中的表达具有很大的差异，这为癌症的治疗提供了一个新的思路。已有研究表明[4]，Claudin-1，4和7在甲状腺癌肿瘤组织中均有表达，Claudin-1基因在乳头状甲状腺癌中也有表达，但是关于Claudin-1在不同类型甲状腺癌肿瘤组织及相应的淋巴结转移区域的表达却一直没有相关报道。因此，在本次研究中，我们使用免疫组织化学方法检测了Claudin-1在不同类型甲状腺癌肿瘤组织及相应的淋巴结转移区域的表达。同时，由于wnt/β-catenin途径在前期的研究中证实是调控结直肠癌致癌作用的信号通路[5]，因此我们也检测了β-catenin蛋白的表达以探索甲状腺癌肿瘤组织中Claudin-1表达的调控机制。
1研究方法
1.1样本资料
选取2012年2月至2013年1月在我院进行手术治疗的63例甲状腺癌患者的肿瘤组织样本，其中男24例，女32例，年龄在21岁-73岁之间，使用福尔马林固定后，采用石蜡包埋切片，包括27例乳头状癌症患者及相应的10例局部淋巴结转移， 17例滤泡性肿瘤和19例滤泡性腺癌。
1.2免疫组化检测蛋白表达[6]
石蜡包埋切片，烤片60℃，1h；脱蜡及复水；加靶标恢复液微波修复，冷却（约5-10min），反复两次；将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，5％BSA室温封闭20min，滴加一抗（claudin-1比例为1:100，β-catenin为1:200）4℃过夜；PBS洗涤3次滴加二抗(1:1000)，37℃孵育30min； PBS洗涤3次；滴加SABC，37℃孵育30min；PBS洗涤3次；DAB显色，自来水冲洗干净，过蒸馏水，苏木素复染2min，自来水冲洗，脱水，树胶封片，镜检。免疫化学反应的结果使用Mirax MIDI Scanner进行扫描，结果定量选取10个代表性的无重叠的视野，使用Mirax MIDI Scanner软件进行分析。
1.3数据统计
使用SPSS17.0软件进行统计分析，将目的蛋白染色的面积进行计算，组间比较采用非参数Mann-Whitney 检验，P＜0.05表示组间有显著性差异。
2结果
2.1 Claudin-1蛋白的表达
从免疫组化的结果来看，27例乳头状癌中的绝大多数（19/27）有claudin-1的阳性表达，且有12例的表达量超大（>5%），claudin-1的表达沿着乳头状癌细胞呈蜂窝状。但是，claudin-1在滤泡性甲状腺癌以及滤泡性腺癌中却没有表达，与乳头状癌中相比明显偏低（P=0.013）。而且肿瘤旁的非恶性甲状腺区域，乳头状癌的阳性表达为4.4%，而其他却为0。以1% claudin-1的表达作为阳性，乳头状癌的70.3%（19/27）表达为阳性，而其他均为阴性。claudin-1在乳头状癌淋巴结转移组织中的阳性表达平均为9.1%。结果如图1，图2和图3所示。
图1 Claudin-1蛋白在各种甲状腺癌的阳性表达
图2 Claudin-1在乳头状癌（a,b）及其颈部转移组织（c,d）的表达
图3 Claudin-1在滤泡性癌（a,b）以及滤泡性腺癌（c,d）的表达
2.2 β-catenin蛋白的表达
β-catenin根据表达量的多少分为0-无表达，1-弱阳性表达，2-中等阳性表达，3-强阳性表达，三种肿瘤患者各等级表达如图4所示。在肿瘤旁的甲状腺组织中均有β-catenin蛋白的表达，其主要表达在细胞膜未成熟的滤泡上，肿瘤组织内，细胞质内也见到β-catenin蛋白的表达。乳头状癌的肿瘤组织及淋巴结转移部分的β-catenin蛋白的表达量较高，显著高于滤泡性癌以及滤泡性腺癌中的表达量，这与claudin-1的表达是一致的。而对于胞浆内β-catenin蛋白的表达，恶性肿瘤（乳头状癌+滤泡性癌）中的表达量要显著高于滤泡性腺癌（P=0.021）。结果如图4和图5所示。
图4β-catenin蛋白在各种甲状腺癌中的表达
图5不同等级β-catenin蛋白在甲状腺癌中的表达
讨论：
乳头状甲状腺癌是一种常见癌症，是最常见的甲状腺肿瘤，具有很强的转移至淋巴结的癌症。本次研究表明，在乳头状甲状腺癌的肿瘤组织以及淋巴结转移组织中，均有claudin-1的高表达，相比之下滤泡性甲状腺癌以及滤泡性腺癌组织中的claudin-1的表达却很少。有研究表明[7]，claudin-1的基因表达可以作为乳头状甲状腺癌的标志物，这与我们本次研究的结果具有一定的一致性。Tzelepi等[8]的研究也表明，claudin-1蛋白在乳头状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌以及滤泡性腺癌中均有表达，且表达量相差不大，与我们本次的研究结果有一定差异，这可能是由于我们本次研究中所选用的组织样本较少以及定量方式不同有关。
研究表明[9]，claudin-1在结肠癌及其转移、胰腺癌、胃癌以及颈部侵袭癌中都有大量表达。在乳头状肾细胞癌中也有claudin-1蛋白的高度表达，可以作为乳头状肾细胞癌诊断的标志物。乳头状癌与滤泡性癌本身的发生发展的通路也是不一样的，因此存在claudin-1蛋白不同的表达。关于claudin-1蛋白的通路目前还存在争论，在结直肠癌的形成过程中，claudin-1蛋白受Wnt/β-catenin信号通路调控，从我们本次的研究结果来看，β-catenin蛋白的表达与claudin-1的表达趋势是一致的，我们推断在甲状腺癌中claudin-1的形成是通过Wnt/β-catenin信号通路。
本次研究结果表明，claudin-1蛋白的表达与β-catenin蛋白的表达是一致的，乳头状甲状腺癌的表达量较高，滤泡性癌以及滤泡性腺癌中的表达量较低，表明claudin-1蛋白是通过Wnt/β-catenin信号通路产生的。
参考文献
[1] 陈帅.Galectin-3 在甲状腺癌诊断中的应用价值[J].实用医学杂志,2012,28(20):3476-3478.
[2] 甘云凤.自身免疫性甲状腺病与甲状腺癌的相关性研究进展[J].实用医学杂志,2013,29(7):1185-1187.
[3] Di CF, Cope L, Li H, et al.Methylation of the claudin 1 promoter is associated with loss of expression in estrogen receptor positive breast cancer[J].PLoS One,2013,8(7): 628-630.
[4] Sastre-Perona A,Santisteban P.Role of the Wnt pathway in thyroid cancer[J].Frontiers in endocrinology,2012,32(2):1021-1024.
[5] Macdonald BT, Tamai K,He X.Wnt/β-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases[J].Developmental cell,2009,17(1):9-26.
[6] Ali AM, Provenzano E, Bartlett J, et al.Prognosis of early breast cancer by immunohistochemistry defined intrinsic sub‐types in patients treated with adjuvant chemotherapy in the NEAT/BR9601 trial[J].International Journal of Cancer,2013,54(12):133-136.
[7] Prasad NB, Kowalski J, Tsai H-L, et al.Three-gene molecular diagnostic model for thyroid cancer[J].Thyroid,2012,22(3):275-284.
[8] Tzelepi VN, Tsamandas AC, Vlotinou HD, et al.Tight junctions in thyroid carcinogenesis: diverse expression of claudin-1, claudin-4, claudin-7 and occludin in thyroid neoplasms[J].Modern pathology,2007,21(1):22-30.
[9] Resnick MB, Konkin T, Routhier J, et al.Claudin-1 is a strong prognostic indicator in stage II colonic cancer: a tissue microarray study[J].Modern pathology,2004,18(4):511-518.
关键词 甲状腺癌；免疫组化；Claudin-1；β-catenin
Expression and regulation of claudin-1 protein in thyroid carcinoma
GUO Xin1, WU Zhi-yu2, CHEN Chun-you1
(Tangshan Gongren Hospital, 1Department of head and neck surgery 2 Department of general surgery and endoscopy, Tangshan Hebei 063000)
Abstract: Objective: To determine the pattern of claudin-1 expression in various types of thyroid lesions at the protein level and investigating the immunolocalization of β-catenin reported to regulate claudin-1 expression. Methods: Tweenty-seven cases of papillary thyroid carcinoma patients, 17 follicular thyroid carcinomas patients and 19 follicular adenomas patients were evaluated by quantitative immunohistochemistry in claudin-1 and β-catenin expression. Results: All cases Conspicuous claudin-1 immunostaining was detected in the majority of papillary thyroid carcinoma and lymph node metastases (19/27 and 9/10, respectively). On the other hand, we found weak or no claudin-1 expression in any of the follicular thyroid carcinomas and follicular adenomas cases. Conclusion: Our data prove that high claudin-1 protein expression is a important marker of thyroid cancer, and the generation of claudin-1 is regulated by wnt/β-catenin pathway in thyroid tumors.
Key words Thyroid cancer; Immunohistochemical; Claudin-1; β-catenin
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤之一，约占恶性肿瘤发生率的1%，绝大多数甲状腺瘤源于滤泡上皮[1]。源于滤泡上皮的肿瘤根据组织和临床特征可以分为低分化型，中等分化型以及高分化型。其中高分化型主要包括乳头状甲状腺癌和滤泡性甲状腺癌。乳头状甲状腺癌是最常见的甲状腺癌，约占甲状腺上皮肿瘤的80%，而更具侵袭性的滤泡性甲状腺癌所占比例却较低[2]。致瘤性转化是一种多步骤的包括一系列分子和形态学的改变，使组织由正常状态转移至稳定的肿瘤状态。Claudin蛋白是一类跨膜蛋白家族，是紧密接头的主要组成部分，Claudin-1是最早被发现的，至今已有24种Claudin蛋白被发现，其致癌作用也在很多肿瘤中被阐明[3]。不同的Claudin蛋白表达在各种癌症包括宫颈癌，结直肠癌，胰脏癌以及肾癌中有表达。而且Claudin蛋白在正常组织中的表达与肿瘤组织中的表达具有很大的差异，这为癌症的治疗提供了一个新的思路。已有研究表明[4]，Claudin-1，4和7在甲状腺癌肿瘤组织中均有表达，Claudin-1基因在乳头状甲状腺癌中也有表达，但是关于Claudin-1在不同类型甲状腺癌肿瘤组织及相应的淋巴结转移区域的表达却一直没有相关报道。因此，在本次研究中，我们使用免疫组织化学方法检测了Claudin-1在不同类型甲状腺癌肿瘤组织及相应的淋巴结转移区域的表达。同时，由于wnt/β-catenin途径在前期的研究中证实是调控结直肠癌致癌作用的信号通路[5]，因此我们也检测了β-catenin蛋白的表达以探索甲状腺癌肿瘤组织中Claudin-1表达的调控机制。
1研究方法
1.1样本资料
选取2012年2月至2013年1月在我院进行手术治疗的63例甲状腺癌患者的肿瘤组织样本，其中男24例，女32例，年龄在21岁-73岁之间，使用福尔马林固定后，采用石蜡包埋切片，包括27例乳头状癌症患者及相应的10例局部淋巴结转移， 17例滤泡性肿瘤和19例滤泡性腺癌。
1.2免疫组化检测蛋白表达[6]
石蜡包埋切片，烤片60℃，1h；脱蜡及复水；加靶标恢复液微波修复，冷却（约5-10min），反复两次；将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，5％BSA室温封闭20min，滴加一抗（claudin-1比例为1:100，β-catenin为1:200）4℃过夜；PBS洗涤3次滴加二抗(1:1000)，37℃孵育30min； PBS洗涤3次；滴加SABC，37℃孵育30min；PBS洗涤3次；DAB显色，自来水冲洗干净，过蒸馏水，苏木素复染2min，自来水冲洗，脱水，树胶封片，镜检。免疫化学反应的结果使用Mirax MIDI Scanner进行扫描，结果定量选取10个代表性的无重叠的视野，使用Mirax MIDI Scanner软件进行分析。
1.3数据统计
使用SPSS17.0软件进行统计分析，将目的蛋白染色的面积进行计算，组间比较采用非参数Mann-Whitney 检验，P＜0.05表示组间有显著性差异。
2结果
2.1 Claudin-1蛋白的表达
从免疫组化的结果来看，27例乳头状癌中的绝大多数（19/27）有claudin-1的阳性表达，且有12例的表达量超大（>5%），claudin-1的表达沿着乳头状癌细胞呈蜂窝状。但是，claudin-1在滤泡性甲状腺癌以及滤泡性腺癌中却没有表达，与乳头状癌中相比明显偏低（P=0.013）。而且肿瘤旁的非恶性甲状腺区域，乳头状癌的阳性表达为4.4%，而其他却为0。以1% claudin-1的表达作为阳性，乳头状癌的70.3%（19/27）表达为阳性，而其他均为阴性。claudin-1在乳头状癌淋巴结转移组织中的阳性表达平均为9.1%。结果如图1，图2和图3所示。
图1 Claudin-1蛋白在各种甲状腺癌的阳性表达
图2 Claudin-1在乳头状癌（a,b）及其颈部转移组织（c,d）的表达
图3 Claudin-1在滤泡性癌（a,b）以及滤泡性腺癌（c,d）的表达
2.2 β-catenin蛋白的表达
β-catenin根据表达量的多少分为0-无表达，1-弱阳性表达，2-中等阳性表达，3-强阳性表达，三种肿瘤患者各等级表达如图4所示。在肿瘤旁的甲状腺组织中均有β-catenin蛋白的表达，其主要表达在细胞膜未成熟的滤泡上，肿瘤组织内，细胞质内也见到β-catenin蛋白的表达。乳头状癌的肿瘤组织及淋巴结转移部分的β-catenin蛋白的表达量较高，显著高于滤泡性癌以及滤泡性腺癌中的表达量，这与claudin-1的表达是一致的。而对于胞浆内β-catenin蛋白的表达，恶性肿瘤（乳头状癌+滤泡性癌）中的表达量要显著高于滤泡性腺癌（P=0.021）。结果如图4和图5所示。
图4β-catenin蛋白在各种甲状腺癌中的表达
图5不同等级β-catenin蛋白在甲状腺癌中的表达
讨论：
乳头状甲状腺癌是一种常见癌症，是最常见的甲状腺肿瘤，具有很强的转移至淋巴结的癌症。本次研究表明，在乳头状甲状腺癌的肿瘤组织以及淋巴结转移组织中，均有claudin-1的高表达，相比之下滤泡性甲状腺癌以及滤泡性腺癌组织中的claudin-1的表达却很少。有研究表明[7]，claudin-1的基因表达可以作为乳头状甲状腺癌的标志物，这与我们本次研究的结果具有一定的一致性。Tzelepi等[8]的研究也表明，claudin-1蛋白在乳头状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌以及滤泡性腺癌中均有表达，且表达量相差不大，与我们本次的研究结果有一定差异，这可能是由于我们本次研究中所选用的组织样本较少以及定量方式不同有关。
研究表明[9]，claudin-1在结肠癌及其转移、胰腺癌、胃癌以及颈部侵袭癌中都有大量表达。在乳头状肾细胞癌中也有claudin-1蛋白的高度表达，可以作为乳头状肾细胞癌诊断的标志物。乳头状癌与滤泡性癌本身的发生发展的通路也是不一样的，因此存在claudin-1蛋白不同的表达。关于claudin-1蛋白的通路目前还存在争论，在结直肠癌的形成过程中，claudin-1蛋白受Wnt/β-catenin信号通路调控，从我们本次的研究结果来看，β-catenin蛋白的表达与claudin-1的表达趋势是一致的，我们推断在甲状腺癌中claudin-1的形成是通过Wnt/β-catenin信号通路。
本次研究结果表明，claudin-1蛋白的表达与β-catenin蛋白的表达是一致的，乳头状甲状腺癌的表达量较高，滤泡性癌以及滤泡性腺癌中的表达量较低，表明claudin-1蛋白是通过Wnt/β-catenin信号通路产生的。
参考文献
[1] 陈帅.Galectin-3 在甲状腺癌诊断中的应用价值[J].实用医学杂志,2012,28(20):3476-3478.
[2] 甘云凤.自身免疫性甲状腺病与甲状腺癌的相关性研究进展[J].实用医学杂志,2013,29(7):1185-1187.
[3] Di CF, Cope L, Li H, et al.Methylation of the claudin 1 promoter is associated with loss of expression in estrogen receptor positive breast cancer[J].PLoS One,2013,8(7): 628-630.
[4] Sastre-Perona A,Santisteban P.Role of the Wnt pathway in thyroid cancer[J].Frontiers in endocrinology,2012,32(2):1021-1024.
[5] Macdonald BT, Tamai K,He X.Wnt/β-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases[J].Developmental cell,2009,17(1):9-26.
[6] Ali AM, Provenzano E, Bartlett J, et al.Prognosis of early breast cancer by immunohistochemistry defined intrinsic sub‐types in patients treated with adjuvant chemotherapy in the NEAT/BR9601 trial[J].International Journal of Cancer,2013,54(12):133-136.
[7] Prasad NB, Kowalski J, Tsai H-L, et al.Three-gene molecular diagnostic model for thyroid cancer[J].Thyroid,2012,22(3):275-284.
[8] Tzelepi VN, Tsamandas AC, Vlotinou HD, et al.Tight junctions in thyroid carcinogenesis: diverse expression of claudin-1, claudin-4, claudin-7 and occludin in thyroid neoplasms[J].Modern pathology,2007,21(1):22-30.
[9] Resnick MB, Konkin T, Routhier J, et al.Claudin-1 is a strong prognostic indicator in stage II colonic cancer: a tissue microarray study[J].Modern pathology,2004,18(4):511-518.