[摘要] 目的 研究HMG-COA还原酶抑制剂辛伐他汀对糖尿病神经痛的保护作用及其机制。方法 1）观察腹腔注射辛伐他汀对糖尿病小鼠机械痛阈值的影响以及是否与甲羟戊酸途径有关；2）研究RhoA/ROCK通路在糖尿病中的作用以及辛伐他汀的干预作用；3）辛伐他汀对RhoA/ROCK通路下游NOS的干预作用。结果 1）辛伐他汀对糖尿病小鼠产生剂量依赖性的镇痛作用，此作用可以被甲羟戊酸所阻断；2）辛伐他汀可以抑制RhoA/ROCK通路；而抑制RhoA和ROCK均可以产生镇痛作用；3）辛伐他汀干预RhoA/ROCK通路使eNOS表达增加，增加NO含量而产生镇痛作用。结论 辛伐他汀通过抑制RhoA/ROCK通路，增加eNOS的表达，增加NO含量从而产生对糖尿病神经痛的镇痛作用。
[关键词] 辛伐他汀；糖尿病；疼痛；RhoA/ROCK通路；一氧化氮
Protective effect -and mechanism of HMG-CoA reductase inhibitor on diabetic peripheral neuropathy
Chen lychee 1 Gao Xuan 2 Huang Jinwei 3 Li Qian 2
（tangshan tangshan neurology hospital 1 medical workers 2 3 hospital branch medical workers Tangshan city, hebei province, 063000）
Chen lizhi 1 Gao xuan2 Huang jinwei3 Lixi2
1 Department of first internal medicine 2 Department of internal neurology 3 Department of branch internal medicine Tangshan worker hospital, Tangshan county, Hebei province. zipcode 06300
 [Abastract] Objective To study the protective effects and mechanism of HMG-COA inhibitors simvastatin on diabetic neuropathic pain. Methods 1） analgesic effect of simvastatin on diabetic mice mechanical allodynia threshold and whether associated with the mevalonate pathway; 2） RhoA/ROCK pathway and diabetic painful relationship with the analgesic effect of simvastatin; 3） expression of NOS through inhibition of RhoA/ROCK pathway by simvastatin on diabetes allodynia. Results 1） the analgesic e ffect of simvastatin was dose dependent on diabetic mice, and blocked by mevalonate; 2） simvastatin inhibited the RhoA/ROCK pathway, while both the RhoA and ROCK inhibitor produced efficacious analgesic effect; 3） RhoA/ROCK pathway increases the expression of eNOS, and then augmented NO content and exhibited analgesic effect. Conclusion Simvastatin inhibits RhoA/ROCK pathway, increases the expression of eNOS, and then increases the content of NO, resulting in analgesic effect on diabetic neuropathic pain.
[Keywords] Diabetes; Simvastatin; Pain; RhoA/ROCK pathway; Nitric oxide
糖尿病神经痛是糖尿病人常见的并发症，主要发生在四肢的末梢，会引起身体一系列的不适感，目前还没有有效的治疗策略。在疼痛出现的早期给予治疗是阻止其发展的一种有效的方式。一系列临床证据表明，血糖控制可以阻止糖尿病
神经病变的起始和发展，而血糖控制失败会引起疼痛的加重[1]。 他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶抑制剂，可以降低血清胆固醇含量。前期的研究表明他汀类药物对糖尿病患者的一系列并发症包括动脉粥样硬化，外周神经功能障碍，神经病变等均有一定的保护作用。他汀类药物主要通过抑制小GTPase如Rho和Ras等使内皮细胞和神经的一氧化氮合成酶（NOS）表达增加，产生大量NO而产生上述作用的[2]。
Rho是G蛋白Ras超家族小分子单体，最近有研究表明[3]，激活RhoA蛋白是糖尿病并发症病理过程中的一个重要环节，在糖尿病小鼠的基底动脉和肠系膜动脉均检测出RhoA蛋白的激活。高血糖状态还会引起大动脉细胞，肾小球系膜和动脉平滑肌细胞RhoA蛋白的激活。RhoA蛋白通过其下游效应器Rho激酶（ROCK）产生效应，阻断RhoA/ROCK信号通路可以缓解糖尿病神经病变的进程。此外，RhoA/ ROCK信号通路还在神经损伤引起的慢性疼痛中对于痛觉信号的传递起着重要的作用。上述研究表明激活RhoA/ROCK信号通路在糖尿病的神经疼痛中起着重要的作用，可能介导了疼痛产生。
他汀类药物对RhoA/ROCK信号通路有一定的影响，他汀类药物对糖尿病神经病变有一定保护作用，而RhoA/ROCK信号通路也可介导了糖尿病神经痛，但是二者之间的关系目前还没有被阐明。在本次研究我们使用了他汀类药物中的代表药物辛伐他汀，首先研究了其对大鼠糖尿病神经痛的镇痛作用，然后我们观察了辛伐他汀是否通过抑制RhoA/ROCK信号通路使内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表达增加，产生NO从而表现出镇痛作用。
材料和方法
1.实验动物及造模：昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，购自浙江大学实验动物中心，许可证号：SCXK（浙） 2011-0001。准备0.1N 柠檬酸溶液，pH4.5，将链脲霉素溶解，以200mg/kg剂量单次腹腔注射建立小鼠糖尿病模型。 动物血糖含量高于400mg/dl时模型成立并进行下一步实验。
2.实验药品及仪器：甲羟戊酸， 辛伐他汀，链脲霉素，外切酶C3和Y27632等均购自美国Sigma公司；western blot中所有抗体均购自美国Santa cruz公司；血糖仪及血糖试纸，瑞士罗氏公司；Ugo电子测痛仪，意大利Ugo公司。
3.鞘内注射及机械疼痛的测定：小鼠鞘内注射参考Hylden[4]等的方法，在L5-6之间直接使用微量进样器刺进后，待小鼠出现甩尾反应表示脊髓，即可以进行注射。机械疼痛的测定使用Ugo电子测痛仪测定，将小鼠放在镂空钢丝网格上，适应环境30min后，使用7号纤维丝接触小鼠足底部，足部抬起的阈值即为痛阈值（g），每脚测定3次，取平均值。
4.Western blot（蛋白免疫印迹）方法：小鼠断头处死后迅速取出脊髓，在冰浴的蔗糖溶液（20mM Tris-HCl ,pH 7.4, 2mM EDTA, 0.5mM EGTA, and 1mM PMSF, 250 μg/ml亮肽素，250μg/ml 抑肽酶，0.32 M 蔗糖）中匀浆，以1000g 4℃离心10min, 取上清9000g 4℃离心20min。为进一步分离胞质包膜，取出上清以100,000g，4℃ 超速离心60min，得到的上清为胞质。将沉淀以冰浴的无蔗糖Tris缓冲液重悬，100,000g超速离心60min，弃上清，Tris缓冲液重悬沉淀。用Bradford 蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scienti?c Inc., Suwannee,GA）测定蛋白浓度。用2×电泳缓冲液（2%SDS,10%甘油，0.2M 二硫苏糖醇）将胞质、胞膜蛋白稀释成相同浓度。SDS-PAGE（RhoA 12%胶，eNOS、nNOS 8%胶）分离蛋白（20μg）。电泳后，将蛋白在Tris/甘氨酸缓冲液（100 mM Tris ,192 mM甘氨酸，5%甲醇）中转移到硝酸纤维素膜上。在含3%牛血清白蛋白的TBST（Tris盐缓冲液，pH7.6, 0.05%Tween-20）中室温慢摇封闭1h，再将膜用TBST洗3次，10min/次。杂交一抗，4℃过夜，鼠单克隆抗体RhoA（1:500）； nNOS （1:5000） ；eNOS （1:1000）。隔天将膜在TBST中洗3次，TBS中洗2次，5min/次，用增强型化学发光法检测抗原-抗体过氧化物酶复合物，在伯乐image系统（美国伯乐公司）中曝光。条带的光密度和半定量分析用NIH Image J软件分析。每只小鼠的RhoA, nNOS, eNOS 都以各自的β-actin标准化。
5.研究方法：
5.1辛伐他汀的镇痛作用及其与甲羟戊酸途径的关系：取糖尿病小鼠40只及正常小鼠10只，检测机械痛阈值后分为正常组，模型组和辛伐他汀（5,10和20mg/kg组），每组10只，每组小鼠腹腔注射相应剂量药物（正常组和模型组注射等容量生理盐水）连续7天，待末次药后30min，分别检测上述小鼠相应的机械痛阈值的变化。取糖尿病小鼠40只，分为模型组，甲羟戊酸（30mg/kg），辛伐他汀（20mg/kg）和甲羟戊酸（30mg/kg）+辛伐他汀（20mg/kg）组，每组10只，每组小鼠腹腔注射相应剂量药物（模型组注射等容量生理盐水）连续7天，待末次药后30min，分别检测上述小鼠相应的机械痛阈值的变化。
5.2 糖尿病小鼠胞内外RhoA蛋白表达以及辛伐他汀对其的影响：分别取正常小鼠20只及糖尿病小鼠20只，分别在一周及两周时各处死一半，分别检测两组小鼠脊髓胞浆和膜上RhoA蛋白的表达，计算膜蛋白比（即膜蛋白量/膜蛋白量+胞浆蛋白量）；另取常小鼠10只及糖尿病小鼠10只，两组小鼠分别腹腔注射辛伐他汀（20mg/kg）连续7天，末次药后30min检测两组小鼠脊髓胞浆和膜上RhoA蛋白的表达，计算膜蛋白比。
5.3 RhoA蛋白抑制剂C3和ROCK抑制剂Y27632对糖尿病神经痛小鼠机械痛阈值的影响：取糖尿病小鼠40只及正常小鼠10只，分为正常组，模型组和C3（2.5,5和10pg），每组10只，每组小鼠鞘内注射相应剂量药物（正常组和模型组注射等容量生理盐水），分别检测各鼠给药前以及给药后30,60和90min的机械痛阈值。另取糖尿病小鼠40只及正常小鼠10只，分为正常组，模型组和Y27632（1,2和4μg），每组10只，每组小鼠鞘内注射相应剂量药物（正常组和模型组注射等容量生理盐水），分别检测各鼠给药前以及给药后30,60和90min的机械痛阈值。
5.4 糖尿病小鼠eNOS和nNOS的变化以及辛伐他汀的对其表达的影响：分别取正常小鼠10只及糖尿病小鼠10只处死，分别检测两组小鼠脊髓内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）和神经型一氧化氮合成酶（nNOS）蛋白的表达；另取常小鼠10只及糖尿病小鼠10只，两组小鼠分别腹腔注射辛伐他汀（20mg/kg）连续7天，末次药后30min检测两组小鼠脊髓脊髓eNOS蛋白的表达。
5.5 NO的外源性供体硝普钠对糖尿病神经痛小鼠的镇痛作用：取糖尿病小鼠40只及正常小鼠10只，分为正常组，模型组和硝普钠（300,600和1200ng），每组10只，每组小鼠鞘内注射相应剂量药物（正常组和模型组注射等容量生理盐水），分别检测各鼠给药前以及给药后30,60和90min的机械痛阈值。
6.数据统计：使用SPSS18.0软件进行统计分析，数据采用平均值±SD（ ±s）计算，各组间数据统计学比较采用单因素和双因素重复检验方差分析，并进行Newman-Keuls 检验， P＜0.05表示数据有显著性差异。
结 果
从结果可以看出，辛伐他汀对于糖尿病神经痛具有剂量依赖性的镇痛作用，此作用是通过甲羟戊酸途径实现的，辛伐他汀可以抑制其下游RhoA蛋白从胞浆向膜的转移，作为RhoA和ROCK的抑制剂C3和Y27632，均产生了良好的镇痛作用。同时，辛伐他汀抑制RhoA/ROCK通路后，其下游的eNOS蛋白而不是nNOS蛋白表达增加，从而产生了NO产生了镇痛作用。具体结果如下所示。
1.辛伐他汀的镇痛作用及其与甲羟戊酸途径的关系：从图1A可以看出，糖尿病小鼠的机械痛阈值仅为2.4g左右，与正常小鼠的4g相比显著降低，而连续7天腹腔注射辛伐他汀后可以剂量依赖性的升高糖尿病小鼠的痛阈值，表明辛伐他汀具有很好的镇痛作用。从图1B可以看出，辛伐他汀（20mg/kg）的镇痛作用完全可以被甲羟戊酸（30mg/kg）所拮抗，而甲羟戊酸（30mg/kg）本身对小鼠的痛阈值没有影响，表明辛伐他汀对糖尿病小鼠的镇痛作用与甲羟戊酸途径有关。
 图1 辛伐他汀对糖尿病神经痛小鼠机械疼痛的镇痛作用及其甲羟戊酸的影响。A，腹腔注射辛伐他汀（5,10,20mg/kg）7天对小鼠机械痛阈值的影响；B，腹腔注射甲羟戊酸（20mg/kg）对辛伐他汀（20mg/kg）镇痛作用的影响。*，与模型组相比，P＜0.05；#，与辛伐他汀组相比，P＜0.05。
2.糖尿病小鼠胞内外RhoA蛋白表达以及辛伐他汀对其的影响：图2A的结果表明，在第1周和第2周，糖尿病小鼠的RhoA蛋白膜蛋白比与正常小鼠相比显著升高。在腹腔注射辛伐他汀（20mg/kg）后，正常小鼠的RhoA蛋白膜蛋白比没有变化，而糖尿病小鼠则显著降低，这表明辛伐他汀对糖尿病小鼠的作用与RhoA蛋白由胞浆向膜上的转移密切相关。
图2 糖尿病小鼠胞内外RhoA蛋白表达以及辛伐他汀对其的影响。A，Wetern blot检测正常小鼠和糖尿病模型小鼠膜RhoA蛋白比例在两周的变化，上为条带，下为灰度值；B，Wetern blot检测正常小鼠和糖尿病模型小鼠膜RhoA蛋白比例在给予辛伐他汀（20mg/kg）的变化，上为条带，下为灰度值。*，与正常组相比，P＜0.05。
3.RhoA蛋白抑制剂C3和ROCK抑制剂Y27632对糖尿病神经痛小鼠机械痛阈值的影响：从图3A和图3B可以看出，鞘内注射RhoA蛋白抑制剂C3和ROCK抑制剂Y27632均可以剂量依赖性的升高糖尿病小鼠的痛阈值， 最大效应的时间均出现在给药后30min，C3（2.5,5和10pg）和Y27632（1,2和4μg）均有很好的镇痛作用，表明RhoA/ROCK通路的激活与糖尿病神经痛密切相关，而直接抑制此通路则可以产生镇痛作用。
图3 RhoA蛋白抑制剂C3和ROCK抑制剂Y27632对糖尿病神经痛小鼠机械痛痛的镇痛作用。A，鞘内注射C3（2.5,5和10pg）对糖尿病小鼠机械痛阈值的影响；B，鞘内注射Y27632（1,2和4μg）对糖尿病神经痛小鼠机械痛阈值的影响。
4.糖尿病小鼠eNOS和nNOS的变化以及辛伐他汀的对其表达的影响：从图4A可以看出，正常小鼠脊髓的eNOS和nNOS蛋白均没有变化，而糖尿病小鼠脊髓的nNOS蛋白没有变化而eNOS则有显著的降低。图4B的结果表明，腹腔注射辛伐他汀对正常小鼠的eNOS蛋白表达没有影响，却可以增加糖尿病小鼠eNOS的表达，表明辛伐他汀可以通过增加eNOS蛋白表达而产生NO。
图4 糖尿病小鼠eNOS和nNOS的变化以及辛伐他汀的对其表达的影响。A，Wetern blot正常小鼠和糖尿病模型小鼠eNOS和nNOS的表达，上为条带，下为灰度值；B，Wetern blot检测正常小鼠和糖尿病模型小鼠eNOS在给予辛伐他汀（20mg/kg）的变化，上为条带，下为灰度值。
5.NO的外源性供体硝普钠对糖尿病神经痛小鼠的镇痛作用：图5的结果表明，鞘内注射NO的外源性供体硝普钠（300,600和1200ng）可以剂量依赖性的升高糖尿病小鼠的痛阈值， 在给药后30min镇痛作用最强，硝普钠具有很好的镇痛作用，表明脊髓NO可以对糖尿病神经痛小鼠产生镇痛作用。
图5 NO的外源性供体硝普钠对糖尿病神经痛小鼠的镇痛作用。鞘内注射硝普钠（300,600和1200ng）糖尿病神经痛小鼠机械痛阈值的影响。
讨 论
本次研究的结果表明，辛伐他汀通过抑制了脊髓RhoA的活性从而增加了eNOS的表达，使NO含量增加，从而产生了对糖尿病神经痛的镇痛作用。已经有相关报道证实HMG-CoA还原酶抑制剂可以改善糖尿病并发症，给予瑞舒伐他汀可以改善糖尿病大鼠的痛觉过敏以及坐骨神经运动和隐静脉感觉神经传导的缺陷[5]。辛伐他汀也可以改善I型糖尿病病人早期的神经源性疼痛症状[6]。我们本次研究也证实了辛伐他汀对糖尿病小鼠神经痛的镇痛作用。
RhoA/ROCK通路的激活在糖尿病并发症中的作用引起了越来越多的关注，在糖尿病模型动物中已经观察到了在肾皮质和主动脉RhoA 易位的增加，膜相关的RhoA也在高糖处理的肾小球膜细胞中有增加[7]。鞘内注射辛伐他汀可以减少RhoA的易位，增加热辐射疼痛和机械痛的痛阈值。给予RhoA特异性抑制剂肉毒梭菌C3胞外酶以及Rho激酶抑制剂Y27632后可以显著增加糖尿病神经痛小鼠的热甩尾的疼痛阈值和机械疼痛的阈值。而对于正常小鼠却没有上述作用。前期的研究结果也证实[8]，糖尿病神经病变与RhoA/ROCK通路的激活密切相关。
在本次研究中，膜上的RhoA表达在糖尿病小鼠的脊髓也显著增加，RhoA/ROCK的激活可以引起痛觉过敏，鞘内注射溶血磷脂酸可以通过激活RhoA/ROCK使小鼠产生长时间的痛觉过敏。ROCK抑制剂可以在各种疼痛模型中都产生镇痛作用。鞘内注射甲羟戊酸可以引起痛觉过敏，而这种作用可以被及Rho激酶抑制剂Y27632所缓解，而HMG-CoA还原酶正是甲羟戊酸合成途径中的限速酶，表明HMG-CoA还原酶抑制剂在脊髓的作用与RhoA/ROCK途径有关。HMG-CoA还原酶抑制剂调节着一些列小G蛋白的功能，包括Ras, Rho Rab, Rac, Ral 和 Rap等[9]。他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶介导类异戊二烯成分的减少，而类异戊二烯作为脂质附属物参与了一系列小G蛋白的翻译后修饰，从而使这些蛋白从胞质易位到胞膜。本次研究中，辛伐他汀可以使糖尿病小鼠脊髓膜RhoA水平降低到正常水平。有研究表明，他汀类药物改善糖尿病小鼠肾形态和功能的作用主要是通过抑制RhoA/ROCK途径[8]。
RhoA/ROCK途径激活后可以通过降低内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达而降低NO的含量。他汀类药物对内皮型NO合成酶（eNOS）的稳定性具有重要的作用，可以增加eNOS在内皮细胞的含量。本次研究表明，在糖尿病小鼠脊髓中eNOS含量以及NO代谢产物均有显著的减少，而nNOS（神经型一氧化氮合成酶）含量则没有变化，上述作用均可被辛伐他汀拮抗。在使用辛伐他汀治疗后，脑组织的eNOS的mRNA含量有增加，而nNOS和iNOS的mRNA含量则没有变化。之前的研究表明，瑞舒伐他汀可以增加阴茎海绵体和主动脉的NO含量。而且，在MSC80细胞中，在高糖状态下可以降低NO的含量，而瑞舒伐他汀可以使NO含量增加[10]。NO在外周神经系统以及中枢神经系统中发挥着重要的作用。关于NO对疼痛的影响目前还有争论，NO可以加重疼痛，炎症性的痛觉过敏以及神经源性疼痛，但同时也具有镇痛作用。在福尔马林疼痛模型中，低剂量的NO前体物L-精氨酸具有致痛作用，而高剂量L-精氨酸则具有镇痛作用。近期的研究结果证实，鞘内注射L-精氨酸可以对糖尿病小鼠以及长春新碱诱导的神经源性疼痛均具有镇痛作用[11]。我们本次的结果表明，增加NO含量的药物硝普钠也可以产生镇痛作用，表明辛伐他汀的镇痛作用是通过增加脊髓NO含量。
综合以上的结果可以表明，以辛伐他汀为代表的他汀类药物通过抑制RhoA/ROCK途径增加eNOS含量从而增加NO的含量对糖尿病小鼠产生镇痛作用。
参考文献
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