[摘要] 目的 研究丁基苯酞对局部脑缺血损伤引起的脑梗死的保护作用及分子机制研究。方法 大鼠造局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO），观察丁基苯酞对脑梗死率的影响，以及与PI3K/Akt通路的关系。结果 丁基苯酞（10, 30 mg/kg）给药后可以使MCAO大鼠的脑梗死率由41.2%降低至20%左右，并且引起pAkt表达的增加和caspase-3表达的降低。而同时给予PI3K抑制剂LY294002后，可以拮抗丁基苯酞引起的MCAO大鼠脑梗死率降低、pAkt表达的增加和caspase-3表达的降低。结论 丁基苯酞通过激活PI3K/Akt通路对局部脑缺血损伤引起的脑梗死产生保护作用。
[关键词] 丁基苯酞；脑缺血；脑梗死；PI3K/Akt
 
Protective effects and molecular mechanism of butylphthalide on focal cerebral ischemia injury-induced cerebral infarction through activation of PI3K/Akt pathway
YIN Chun-li, WANG Yao-wu, LIU Ying, GAO Hai-feng ,LI Yong-qiu,
（Department of neurology, Tangshan Gongren hospital, Tangshan Hebei 063000）
[Abstract] Objective To determine the protective effects and molecular mechanism of butylphthalide on focal cerebral ischemia injury-induced cerebral infarction. Methods The rats were builded with focal cerebral ischemia reperfusion model (MCAO), the effect of butylphthalide on the rate of cerebral infarction, and the relationship with PI3K/Akt pathway were investigated. Results MCAO rats cerebral infarction rate were decreased from 41.2% to about 20% after administration of butylphthalide (10, 30 mg/kg), while the pAkt expression was decreased and caspase-3 expression was increased. After given the PI3K inhibitor LY294002, the butylphthalide-induced deduction of cerebral infarction, the expression of pAkt and caspase-3 were all antagonized. Conclusion Butylphthalide has a protective effect in focal cerebral ischemia injury-induced cerebral infarction by activation of the PI3K/Akt pathway.
[Key words] Butylphthalide; Cerebral ischemia; Cerebral infarction; PI3K/Akt
 
缺血性脑血管病(ischemia cerebrovascula diseases，ICD)在临床上发病率、致
残率高，是我国临床病人主要的病死原因之一^[1]。脑缺血是一个复杂的病理生理过程, 医学理论和临床实践都认为超早期溶栓是本病治疗的关键，而随溶栓带来的再灌注损伤一直是国内外医学者备受关注的问题。一方面，脑缺血再灌注既可挽救濒临梗死的细胞，另一方面却也加重了细胞损伤，导致细胞死亡，并没有减少脑梗死^[2]。近年来，对ICD的治疗研究重点逐渐进入一个新领域，即通过提高脑组织自身抗缺血能力来减轻缺血与缺血再灌住对脑组织的损伤。丁基苯酞（Butylphthalide）是一种在临床广泛应用的、有效的治疗ICD的药物，可以改善急性缺血性脑卒中患者的神经功能，减少脑缺血后引起的脑梗死，增加脑血流量，改善缺血部位的微循环和能量代谢，还可以抑制神经细胞的凋亡^[3]。最近的研究结果表明^[4]，丁基苯酞对于心肌损伤也有一定的保护作用。但是，关于丁基苯酞对局部脑缺血损伤引起的脑梗死的保护作用的分子机制还不是完全清楚，本次研究在研究了丁基苯酞对局部脑缺血损伤引起的脑梗死的保护作用的基础上进一步研究了其分子机制，现将结果报道如下。
材料与方法
1实验材料
1.1实验试剂: 丁基苯酞（商品名：恩必普），由石药集团恩必普药业生产，批号：120921；LY294002，购自美国Selleck公司； 2%氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)：分析纯，由中国国药（集团）上海化学试剂公司提供（批号：SCRC30187713），用蒸馏水配成2%浓度备用；水合三氯乙醛：分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供（批号30037517），用蒸馏水配成3.5%浓度备用；肌酸激酶（CK）测定试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒：由南京建成生物工程研究所提供（批号：20120520）；肝素钠注射液：由江苏万邦生化医药股份有限公司生产，批号：1112120；Akt，P-Akt（Ser473），Cleavet-casapase3和GAPDH的一抗及二抗均购自美国Santa Cruz公司。
1.2实验仪器: 分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；冷冻离心机：德国Eppenddorf公司生产；恒温水浴锅：江苏金坛市金城国胜试验仪器厂；酶标仪：上海精密科学仪器有限公司；蛋白印迹设备：美国Biorad公司生产。
1.3实验动物: 健康成年Wistar大鼠，雄性，体重280±20g，由上海斯莱克动物中心提供，合格证号：SCXK（沪）2010-0001。
2模型制备: 取直径0.285mm的进口钓鱼用尼龙线，长约6.0m，将其一端于火焰上迅速灼烧后拎起，使该端形成球状膨大，在距膨大端20mm处标记，至于0.9%生理盐水中备用。 参照Zea Longa的方法制备大鼠脑中动脉缺血再灌注（MCAO）模型^{[2; 5]}。大鼠称重后以3.5%水合氯醛1 ml/kg腹腔内注射麻醉。固定,颈部皮肤消毒, 颈部左侧矢状切口,暴露左侧颈总动脉（CCA）和颈外动脉(ECA),分离并用电凝器切断颈外动脉的分支枕动脉、甲状腺上动脉和咽升动脉,然后分离颈内动脉(ICA),小心分离并电凝切断ICA在颈部的唯一分支翼腭动脉(PPA).结扎和切断ECA,用丝线套住ECA的残端,用微血管夹在ECA起始处夹闭CCA,同时夹闭ICA。在ECA残端上剪一小口，轻轻牵拉ECA残端以增大它与ICA的夹角，将制备好的尼龙线栓插入,轻轻推进尼龙线使之由ECA通过分叉处进入ICA.推进尼龙线的长度约为20mm左右，扎紧丝线。此时尼龙线的前端进入了大脑前动脉（ACA）,从而阻断大脑中动脉（MCA）起始端及其所有侧支血流循环,而ACA可通过前交通动脉获得血流.导致MCA局灶缺血.于此时开始计时，2h后，轻轻回抽插线至微有阻力，此时提示尼龙线膨大端已达ECA切口处,MCA血流恢复，制成再灌注模型。假手术组除不插入线栓外，其余操作同上。
 
3指标及检测方法
3.1神经行为学评分：各组再灌注24h后， 参考Zea Longa评分方法，将大鼠行为分为9个等级，评分标准为：大鼠没有不对称活动，0分；大鼠尾部提起左前肢伸展不完全，1分；大鼠在1分的基础上伴有左前肢活动障碍，2分；大鼠左前肢紧贴住胸壁，3分；大鼠自由活动时向左侧转弯，4分；大鼠在4分的基础上有明显的左前爪后拖动作，5分；大鼠只能围绕原地向左旋转，6分；大鼠左侧肢体完全不能支撑身体重量仅能躺在左侧，7分；大鼠死亡8分。比较各组神经功能评分，1-7分视为造模成功，分数越高，说明动物行为障碍越严重。
3.2脑梗死百分率：各组大鼠再灌注24h后，每组取出5只用3.5%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血后，迅速断头取脑，去除嗅脑、小脑、低位脑干，称取大脑湿重，置-20℃冰箱中冷冻20min，取出后用手术刀片将脑组织冠状切成五片，每片约厚2mm。然后迅速将脑片置于浓度为2%的TTC溶液中，37℃避光温孵30min，每隔7-8分钟翻面一次。经染色后，正常脑组织呈攻瑰红色，而梗死组织呈苍白色。拍下染色照片，使用Photoshop软件计算梗死率：梗死率（％）＝苍白区×100% /全脑。
3.3 Western blot：大鼠断头处死后迅速取出全脑，各组取造模侧半脑在冰浴的蔗糖溶液（20 mM Tris–HCl ,pH 7.4, 2 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, and 1mM PMSF, 250 μg/ml亮肽素,250μg/ml 抑肽酶,0.32 M 蔗糖）中匀浆，以1000 g 4℃离心10min, 取上清9000g 4℃离心20min。为进一步分离胞质包膜，取出上清以100,000g，4℃ 超速离心60 min，得到的上清为胞质。将沉淀以冰浴的无蔗糖Tris缓冲液重悬，100,000 g超速离心60 min，弃上清，Tris缓冲液重悬沉淀。用Bradford 蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc., Suwannee,GA）测定蛋白浓度。用2×电泳缓冲液(2%SDS,10%甘油,0.2M 二硫苏糖醇)将胞质、胞膜蛋白稀释成相同浓度。SDS-PAGE(10%胶)分离蛋白（20μg）。电泳后，将蛋白在Tris/甘氨酸缓冲液(100 mM Tris ,192 mM甘氨酸,5%甲醇)中转移到硝酸纤维素膜上。在含3%牛血清白蛋白的TBST（Tris盐缓冲液，pH7.6, 0.05%Tween-20）中室温慢摇封闭1h，再将膜用TBST洗3次，5 min/次。孵育各蛋白的一抗，4℃过夜。隔天将膜在TBST中洗3次，5 min/次，孵育二抗1 h，孵育结束后将膜在TBST中洗3次，5 min/次，用增强型化学发光法检测抗原-抗体过氧化物酶复合物，在伯乐image系统（美国伯乐公司）中曝光。条带的光密度和半定量分析用NIH Image J软件分析，使用GAPDH标准化。
4统计学方法：使用SPSS18.0软件进行统计分析，所有数据用均数±标准差( ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析post-hoc student t检验，P<0.05表示结果有统计学意义。
实验结果
1丁基苯酞对MCAO大鼠的脑梗死的保护作用：取大鼠40只，分为假手术组（Sham），模型组（Model），丁基苯酞低剂量组（B, 10 mg/kg）和丁基苯酞高剂量组（B, 30 mg/kg），每组10只。各组动物手术前均连续灌胃给药5天，于第5天给药后30 min后除假手术组外均造模。高剂量药物组给予丁基苯酞 (30 mg/kg),低剂量药物组给予丁基苯酞(10 mg/kg)。模型组和假手术组给予等量（10ml/kg）生理盐水。再灌注术后大鼠于1 h内清醒，术后24 h所有大鼠均可自由饮水和摄食。麻醉清醒后，假手术组大鼠活动正常，基本无神经功能缺损的症状，神经行为学评分为0分。模型组和药物组大鼠于再灌注24h均出现明显的右侧Horner征和左前肢屈曲的表现。如图1所示，与模型组比较，丁基苯酞各组大鼠分值均有降低 (P<0.05)。表明丁基苯酞对MCAO后24h神经功能缺损有一定的保护作用，可以改善脑缺血再灌注损伤所致的神经功能障碍。

图1丁基苯酞对MCAO大鼠神经功能评分的影响（ ±s）。*，P＜0.05，与假手术组相比；#，P＜0.05，与模型组相比。
各组大鼠在评分后，将大鼠断头处死，取大鼠全脑使用2%TTC进行染色，结果如图2所示，模型组的梗死率约在41.2%，给药后，两组剂量的丁基苯酞均可以显著降低大鼠的脑梗死率至26.8%和19.5%（P<0.05），表明丁基苯酞可以降低MCAO大鼠的脑梗死率。

图2丁基苯酞对MCAO大鼠的脑梗死率的影响（ ±s），上插图为TTC染色照片。*，P＜0.05，与假手术组相比；#，P＜0.05，与模型组相比。
 
在处死大鼠的同时，取大鼠血3 ml，用肝素抗凝后，离心3000 r/min，共10 min，取血浆备用。分别使用CK和LDH检测血浆中二者的含量。从图3可以看出，模型组大鼠的CK和LDH水平相对于假手术组显著升高（P<0.05），而丁基苯酞10和30 mg/kg均可以显著降低二者的含量（P<0.05）。

图3丁基苯酞对MCAO大鼠血浆CK和LDH含量的影响（ ±s）。*，P＜0.05，与假手术组相比；#，P＜0.05，与模型组相比。
2丁基苯酞对MCAO大鼠脑PI3K/Akt通路的影响：取大鼠40只，分为假手术组（Sham），模型组（Model），丁基苯酞量组（B, 30 mg/kg）和丁基苯酞（30 mg/kg）联合PI3K （Phosphatidylinositol 3-kinase）特异性抑制剂LY294002（LY, 10 mg/kg）组（B+LY），每组10只。各组动物手术前均连续灌胃给药5天，于第5天给药后30 min后除假手术组外均造模。各组大鼠给予相应药物，模型组和假手术组给予等量（10ml/kg）生理盐水。将大鼠断头处死，取大鼠全脑使用2%TTC进行染色，结果如图4所示，模型组的梗死率为44.3%左右，给药后，丁基苯酞（30 mg/kg）可以降低大鼠的脑梗死率至19.8%，而丁基苯酞（30 mg/kg）和LY294002（10 mg/kg）联合给药后，大鼠的梗死率为40.4%左右，表明PI3K抑制剂LY294002可以拮抗丁基苯酞对MCAO大鼠脑梗死的保护作用。

图4 LY294002对丁基苯酞降低MCAO大鼠脑梗死率的影响（ ±s），上插图为TTC染色照片。*，P＜0.05，与假手术组相比；#，P＜0.05，与模型组相比；△，P＜0.05，与丁基苯酞组相比。
为了确认丁基苯酞对PI3K下游通路的影响，分别取大鼠40只，分为假手术组（Sham），模型组（Model），丁基苯酞量组（B, 30 mg/kg）和丁基苯酞（30 mg/kg）联合PI3K激酶特异性抑制剂LY294002（10 mg/kg）组（B+LY），每组10只。各组动物手术前均连续灌胃给药5天，于第5天给药后30 min后除假手术组外均造模。各组大鼠给予相应药物，模型组和假手术组给予等量（10ml/kg）生理盐水。将大鼠断头处死，取大鼠脑，Western blot检测大鼠脑部PI3K激酶下游的总Akt和磷酸化P-Akt（Ser473）的蛋白表达（pAkt），以及pAkt下游的cleaved caspase-3的蛋白表达。结果如图5和图6所示，MCAO大鼠pAkt表达显著降低，cleaved caspase-3的表达显著增加，而总Akt没有变化，丁基苯酞可以显著增加模型大鼠脑pAkt的表达和降低cleaved caspase-3的表达，而这种作用可以被LY294002所阻断，表明丁基苯酞的这些作用与PI3K/Akt通路有关。

图5丁基苯酞对MCAO大鼠Akt磷酸化（pAkt）表达的影响（ ±s），上插图为Western blot条带。*，P＜0.05，与假手术组相比；#，P＜0.05，与模型组相比；△，P＜0.05，与丁基苯酞组相比。

图6丁基苯酞对MCAO大鼠cleaved caspase-3（C-3）表达的影响（ ±s），上插图为Western blot条带。*，P＜0.05，与假手术组相比；#，P＜0.05，与模型组相比；△，P＜0.05，与丁基苯酞组相比。
讨论
研究药物的分子机制对于药物的使用、新药的开发具有重要的作用，药物作用的分子靶点的发现可以有助于药物的优化和新药的诞生。丁基苯酞在临床已经广泛使用，对于缺血性脑血管病显示出了良好的疗效。以往的研究显示，丁基苯酞可以增强线粒体ATP酶的活性，减少细胞内钙离子浓度引起的神经损伤，具有抗氧化作用，可以增加脑内SOD的含量和还原性谷胱甘肽的含量^[6]，同时，也可以上调脑缺血部位VEGF（血管内皮生长因子）和bFGF（碱性成纤维生长因子）的表达^[7]，起到脑损伤保护的作用。但是上述研究的结果均没有进行干预实验，仅仅在现象上表现为含量的增高或活性的增强，并没有指明丁基苯酞降低MCAO大鼠脑梗死率的途径。本次研究的而结果表明，MCAO大鼠在造模侧出现脑梗死，pAkt增加并引起下游的凋亡基因cleaved caspase-3的表达增加，而丁基苯酞可以显著降低MCAO大鼠的脑梗死率，pAkt降低，从而引起了凋亡基因cleaved caspase-3的表达降低。同时，在给予PI3K抑制剂LY294002后可以逆转丁基苯酞对于MCAO大鼠脑梗死率、pAkt和cleaved caspase-3的表达的影响，表明丁基苯酞对于MCAO大鼠脑梗死的保护作用是通过PI3K通路。
PI3K/Akt通路已经证实在促进细胞存活中起着重要的作用，可以抑制细胞的凋亡并增加细胞的存活，与许多肿瘤都有密切的关系，胃肠道肿瘤，乳腺癌，肺癌和前列腺癌等^[8]。最近有研究表明^[9]此通路可以维持或增加神经元的存活。凋亡基因主要调控着细胞的程序性死亡，而在一些病理情况下，凋亡基因大量表达则会增加正常细胞的凋亡。Akt磷酸化后可以抑制一系列凋亡通路保护细胞的存活，包括Bcl-2，p53，caspase-9和 caspase-3等基因^[10]。抑制PI3K/Akt通路还可以激活caspase-3^[11]，在MCAO大鼠脑部已经检测到造模后caspase-3表达的升高^[12]。本次研究中也可以观察到，模型大鼠的pAkt表达显著降低，从而引起了caspase-3表达的增高，而丁基苯酞正是通过PI3K/Akt通路抑制了caspase-3的表达而减少MCAO大鼠的梗死率。
综上所述，丁基苯酞可以通过激活PI3K/Akt通路对MCAO引起的脑梗死产生保护作用。在MCAO引起的脑梗死中，PI3K/Akt通路下游的其他通路也起着重要的作用，包括Nrf2-ARE（核因子E2相关因子2-抗氧化反应原件）通路，以及eNOS（内皮一氧化氮合成酶）磷酸化通路等^{[13; 14]}。丁基苯酞在激活PI3K/Akt通路后是否对其下游其他通路或基因有影响还不清楚，这些因素与caspase-3表达的关系也有待进一步研究。
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