【摘要】 目的 检测喉鳞状细胞癌患者外周血及癌组织中Th9细胞及白细胞介素-9的表达水平，其与喉鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系。方法 选择66例初治的喉鳞状细胞癌患者和40例健康志愿者。采用流式细胞仪检测外周血Th9细胞水平，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-9表达水平。应用免疫组化染色分析癌旁组织及癌组织中IL-9阳性细胞的浸润程度。分析喉鳞状细胞癌患者外周血Th9细胞、血清中IL-9水平及癌组织中IL-9阳性细胞浸润程度与各临床病理参数间的关系。结果 喉鳞状细胞癌患者外周血中Th9细胞及IL-9水平分别为(2.64±0.24)%和(89.4±6.66) ng/L，显著高于健康对照组[(1.07±0.11)%, t=12.63, P<0.01; (26.8±3.76) ng/L, t=14.37, P<0.01]，III-IV期患者的Th9细胞比例及IL-9水平明显高于I-II期患者[(3.21±0.22%) 比 (2.07±0.19%), t=8.24, P<0.01; (104.3±6.07) ng/L 比 (72.9±5.37) ng/L, t=8.91, P<0.01]。喉鳞状细胞癌患者癌组织中IL-9阳性细胞高浸润率为84.37%(27/32)，而对应癌旁组织为21.87%(7/32)，差异有统计学意义(χ²=25.098, P<0.001)。外周血Th9细胞和IL-9的表达水平与喉鳞状细胞癌的临床分期、肿瘤分化程度、区域淋巴结转明显相关（P<0.05），与年龄、性别、原发灶部位无明显相关（P>0.05）。癌组织中IL-9阳性细胞浸润程度与临床分期、区域淋巴结转移明显相关（P<0.05），与其他临床病理特征无明显相关（P>0.05）。结论 喉鳞状细胞癌患者外周血Th9细胞比例及血浆中IL-9水平显著升高，且与临床分期等病理指标明显相关，提示Th9细胞及IL-9参与喉鳞状细胞癌的发生发展。
【关键词】Th9细胞，白细胞介素9；喉鳞状细胞癌
 
The abnormality and clinical significant of T helper 9 cells and interleukin-9 in patients with laryngeal squamous cell carcinoma
GUO Xin1, WU Zhi-yu2, CHEN Chun-you1, WANG Dong-hai3
1Department of head and neck surgery, Tangshan Gongren Hospital 2 Department of general surgery and endoscopy, Tangshan Gongren Hospital 3 Department of otolaryngology head and neck surgery, Tangshan Xiehe Hospital
【Abstract】Objective To detect the expression of T helper cells 9 (Th9) in the peripheral blood and the level of interleukin(1L)-9 in the plasma and the IL-9 in the tumor tissues of patients with laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC), and to analyze the relationship between Th9/IL-9 and clinical characteristics and their possible role in the immunological pathogenesis of LSCC. Methods Sixty-six patients with LSCC and 40 healthy controls were included. Th9 cells in the peripheral blood were detected by flow cytometry, the concentrations of IL-9 in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemistry(IHC) was used to determine the IL-9 expression in paraffin-embedded tissues with LSCC, the relationship between Th9/IL-9 and clinical characteristics were analyzed. Results The level of Th9 cells in peripheral blood and IL-9 in the serum of patients with LSCC were (2.64±0.24)% and (89.4±6.66) pg/ml, respectively, significantly higher than that of healthy controls [(1.07±0.11)%, t=12.63, P<0.01; (26.8±3.76) pg/ml, t=14.37, P<0.01]. Patients with III-IV stage had higher Th9 cells and IL-9 levels than that of patients with I-II stage [(3.21±0.22)% vs (2.07±0.19)%, t=8.24, P<0.01; (104.3±6.07)pg/ml vs (72.9±5.37) pg/ml, t=8.91, P<0.01]. Compared with peritumor tissues, intratumor tissues showed higher expression of IL-9⁺cells (84.37% vs 21.87%, χ²=25.098, P<0.001 ). The levels of Th9 cells in peripheral blood and IL-9 in serum was associated with tumor stage, tumor differentiation and regional lymph node metastasis (P<0.05), while the IL-9⁺cells in tumor tissues was associated with tumor stage and regional lymph node metastasis (P<0.05). Conclusions There are higher quantification of Th9 cells and IL-9 in the peripheral blood and intratumor tissues in patients with LSCC and they have positive correlation with the clinical stage, Th9 cells and IL-9 may contribute to the disease progression and prognosis of LSCC.
【Keywords】Th9 cells; interleukin-9; laryngeal squamous cell carcinoma
 
Th9细胞是近年来证实的辅助性T淋巴细胞新亚群，由白细胞介素(interleukin, IL)-4和TGF-b共同诱导产生，通过分泌效应细胞因子IL-9在炎症反应、对抗寄生虫感染以及诱导变应性疾病中发挥重要作用^[1]。有研究表明Th9细胞及IL-9在肿瘤的发生发展中也发挥一定的作用，但是其在肿瘤中的确切作用及其机制还有待深入研究^[2]。我们通过检测喉鳞状细胞癌患者外周血及癌组织中Th9细胞及IL-9的表达水平，分析其与喉鳞状细胞癌患者临床病理特征的关系，探讨Th9细胞及IL-9在喉鳞状细胞癌发生发展中的免疫学作用。
资料与方法

1. 一般资料 收集2010年12月至2013年12月在河北唐山工人医院头颈外科及唐山协和医院耳鼻咽喉头颈外科接受治疗的66例喉鳞状细胞癌患者，其中男56例，女10例，年龄29～80岁，中位年龄57.6岁。所有患者均为首次接受治疗，经影像学检查及术后病理诊断均为鳞状细胞癌，其中声门上型7例，声门型50例，声门下型9例。采用UICC (Union for International Cancer Control, 2002) 喉癌分期方案进行TNM分期：I期15例、II期16例、Ⅲ期23例、Ⅳ期12例。健康对照组为河北唐山工人医院体检中心的健康志愿者40例，其中男27例，女13例，中位年龄58.4岁(32～79岁)。所有患者签署知情同意书，采血或取组织标本前未经任何抗癌、抗炎及激素治疗，并排除自身免疫性疾病。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人CD4抗体、藻红蛋白(PE)标记的抗人IL-9、别藻蓝蛋白(APC)标记的抗人CD3抗体、藻红蛋白标记的鼠IgG2b同型对照以及IL-9 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国eBioscience公司；佛波酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin)、莫能霉素(Monensin)购自碧云天生物技术有限公司；RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；固定剂、破膜剂购自美国eBioscience公司；淋巴细胞分离液购白天津灏洋生物制品科技有限公司；兔抗人IL-9多克隆抗体（克隆号H-122）及同型对照抗体购自美国Santa Cruz公司；免疫组化SP法染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；流式细胞仪(型号FACS Calibur)为美国BD公司产品，二氧化碳孵育箱购自美国Thermo公司，酶标仪为美国BioTek公司产品。

2. 标本采集：早晨空腹留取各受试对象肝素钠抗凝静脉血2 ml，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，用PBS洗涤细胞2次备用，同时采1ml无抗凝静脉血，离心后留取血清保存于-80℃冰箱中冻存。术中切取32例喉鳞状细胞癌原发病灶及对应癌旁组织，标本经多聚甲醛固定后制成石蜡切片。
3. 细胞染色及流式细胞仪分析：将分离出来的外周血单个核细胞用1ml RPMI-1640调整细胞浓度至1×10⁶/ml，接种于24孔培养板后，加入刺激剂PMA 50ng/ml、Ionomycin 500ng/ml和Monensin 10μg/ml，在37℃、5% CO₂细胞培养箱培养4h后取出，以PBS洗涤2次。每1×10⁶/ml细胞中分别加入APC标记抗人CD3，FITC标记抗人CD4各20μl，避光孵育30 min。随后进行细胞固定、破膜，进行胞内染色，加入PE标记抗人IL-9，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次后，加人200μl染色缓冲液后上机检测。将CD3⁺CD4⁺IL-9⁺T细胞定义为为外周血Th9细胞。
4. ELISA法检测血清中IL-9的水平：采用IL-9 ELISA试剂盒检测血清中IL-9的表达水平，操作过程严格按产品说明书进行，实验中设计空白对照组和阴性对照以保证检测结果的可靠性，所有样本均设置复孔。
5. 免疫组织化学SP法检测组织标本中IL-9的表达：组织标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片厚4μm，按照试剂盒说明书操作进行染色。结果判定：IL-9阳性细胞的判定以胞质呈棕黄色和（或）棕褐色为阳性表达。用奥林巴斯光学显微镜及Image-Pro Plus V6.0图像分析软件40倍物镜下，按照Kuang DM等^[3]方法由不知分组资料的2位病理科医生进行盲法阅片：首先在低倍视野(4×10)下选取细胞分布均匀的区域，然后在高倍视野(High power field HPF)(40×10)下进行阳性细胞计数，随机计数5个高倍视野(HPF)(40×10)的阳性细胞数目，取平均值以阳性细胞数/HPF表示。染色结果分析：细胞数<1为(-)，1～5为(+)，6～19为(++)，≥20为(+++)，以(-)(+)为低浸润，(++)(+++)为高浸润。
6. 统计学方法：应用SPSS16.0统计软件分析，所得数据采用均数±标准差( +S)来表示。组间均数的比较采用t检验，率的比较采用χ²检验，相关分析采用Spearman秩和相关分析。

结 果

1. Th9细胞及IL-9在喉鳞状细胞癌患者外周血中的表达：喉鳞状细胞癌患者外周血中Th9细胞及IL-9水平明显高于健康对照组(t=12.63, P<0.01; t=14.37, P<0.01)，III-IV期患者的Th9细胞比例及IL-9水平明显高于I-II期患者(t=8.24, P<0.01; t=8.91, P<0.01)，结果见表l。IL-9是Th9细胞分泌的特征性细胞因子，也是Th9细胞发挥效应的功能性细胞因子，采用直线相关分析喉鳞状细胞癌外周血Th9细胞水平与相应患者血清IL-9水平的相关性，结果显示两者水平呈正相关( r=0.37, P=0.023)。

表1喉鳞状细胞癌患者与健康对照组外周血Th9细胞及IL-9的比较( +S)

组别	例数	Th9细胞(%)	IL-9 (ng/L)
健康对照组	40	1.07±0.11	26.8±3.76
喉鳞状细胞癌患者	66	2.64±0.24*	89.4±6.66*
I-II期	31	2.07±0.19	72.9±5.37*
III-IV期	35	3.21±0.22*#	104.3±6.07*#
注：与健康对照组比较*P<0.01；与I-II期比较#P<0.01

2. IL-9在喉鳞状细胞癌患者组织中的表达：IL-9 阳性细胞主要分布于癌巢周围，且伴有炎性细胞浸润。IL-9阳性细胞的染色局限于细胞质，细胞核中染色较少。而癌旁组织结构完整，较少见炎性细胞浸润，未见或少见IL-9阳性细胞浸润。喉鳞状细胞患者癌组织中IL-9阳性细胞高浸润率为84.37%(27/32)，而对应癌旁组织为21.87%(7/32)，差异有统计学意义(χ²=25.098, P<0.001)，结果见表2。

表2喉鳞状细胞癌患者癌旁组织与癌组织IL-9阳性细胞浸润程度比较(%)

组别	IL-9阳性细胞水平
	例数	高浸润N(%)	低浸润N(%)
癌组织	32	27(84.37%)	5(15.63%)
癌旁组织	32	7(21.87%)	25(78.13%)

3. Th9细胞和IL-9的表达水平与喉鳞状细胞临床病理特征之间的关系：对喉鳞状细胞癌患者的临床病理特征如临床分期、病理分化级别、区域淋巴结转移以及原发灶部位等与外周血Th9细胞和IL-9的表达水平以及癌组织中IL-9阳性细胞浸润程度的关系进行分析，结果表明，外周血Th9细胞和IL-9的表达水平与喉鳞状细胞癌的临床分期、肿瘤分化程度、区域淋巴结转明显相关（P<0.05），与年龄、性别、原发灶部位无明显相关（P>0.05）。癌组织中IL-9阳性细胞浸润程度与临床分期、区域淋巴结转移明显相关（P<0.05），与其他临床病理特征无明显相关（P>0.05）。结果见表3。

表3. Th9细胞和IL-9的表达水平与喉鳞状细胞临床病理特征之间的关系

临床病理特征	Th9细胞水平		IL-9水平 (ng/L)	IL-9阳性细胞水平
	例数	(`x±SD)	(`x±SD)	例数	高浸润 (n)	低浸润 (n)
性别
男	56	2.71±0.22	89.8±6.54	27	23	4
女	10	2.63±0.17	84.4±7.07	5	4	1
年龄
<60岁	36	2.43±0.27	91.67±7.73	19	15	4
≥60岁	30	2.19±0.24	86.32±6.46	13	12	1
原发灶部位
声门型	50	2.59±0.37	86.34±6.34	25	22	3
非声门型	16	2.68±0.27	89.74±5.98	7	5	2
病理分化级别
低分化	32	2.14±0.19	76.49±7.31	16	13	3
高分化	34	2.79±0.23	98.19±6.58	16	14	2
区域淋巴结转移
无	30	2.27±0.30	77.92±5.53	19	14	5
有	36	2.89±0.27	92.07±6.33	13	13	0
临床分期
Ⅰ-Ⅱ期	31	2.07±0.19	72.9±5.37	18	13	5
Ⅲ-Ⅳ期	35	3.21±0.22	104.3±6.07	14	14	0

 
 
 
讨 论
2008年，Veldhoen^[4]和Dardalhon^[5]分别报道了一群特征性分泌IL-9的CD4⁺T细胞新亚群，并命名为Th9细胞，这群细胞可在IL-4 和TGF-β的诱导下大量分泌IL-9和IL-10。近年来的研究表明Th9细胞在肿瘤的发生发展中也起到一定的作用，但是其在肿瘤细胞增殖、凋亡、浸润以及转移中的作用还不是很清楚。本研究结果显示喉鳞状细胞癌患者外周血Th9细胞的水平较健康对照组明显增多，并且随着分期的加重，Th9细胞的水平也增多。本研究结果显示作为Th9细胞的特征性细胞因子，喉鳞状细胞癌患者血清中IL-9的水平也较健康对照组多，并且随着疾病的进展，IL-9的水平也增多，直线相关分析显示喉鳞状细胞癌外周血Th9细胞水平与相应患者血清IL-9水平呈正相关。同时外周血Th9细胞和IL-9的表达水平与喉鳞状细胞癌的临床分期、肿瘤分化程度、区域淋巴结转有关，而与年龄、性别、原发灶部位等临床特征无关。这些结果表明提示Th9细胞的增多可能是喉鳞状细胞癌的进展的重要原因。封丽丽等^[6]研究发现B细胞非霍奇金淋巴瘤患者血清中IL-9水平明显高于健康对照组；体外实验证实IL-9可以诱导小鼠骨髓来源的肥大细胞的分化及相关基因的表达，包括CD117、Fcerlα、Mcpt1和Mcpt5，提示 IL-9可增强肥大细胞介导的免疫反应，在促进肿瘤的生长中可能起重要作用。
近年来研究表明，在肿瘤发生、发展过程中，由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管及少量浸润细胞，如淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞等共同组成的肿瘤微环境在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。作为肿瘤免疫效应执行的场所，肿瘤微环境内存在许多参与肿瘤组织与免疫系统相互作用的因素，如局部效应细胞功能障碍，肿瘤诱导的抑制性淋巴细胞、细胞因子的免疫负调节作用，抑制性配体受体反应等^{[7; 8]}。鉴于以上研究发现喉鳞状细胞癌患者外周血中Th9细胞及IL-9的水平显著升高，并且与临床分期密切相关，提示Th9细胞及IL-9可能参与了喉鳞状细胞癌的发生发展过程。外周循环中的免疫状态属于全身免疫，受患者身体状况、所处环境、饮食等多种因素影响，而肿瘤组织中免疫状态受外部影响较小，并且肿瘤微环境中的Th9细胞与肿瘤细胞、周围浸润的淋巴细胞及多种细胞因子等可直接作用，故对肿瘤组织的研究更能反映Th9细胞及IL-9的生物学效应，因此我们分析了IL-9在喉鳞状细胞癌患者组织中的表达水平，以探讨IL-9对肿瘤患者局部免疫情况的影响。本研究结果显示IL-9 阳性细胞主要分布于癌巢周围，且伴有炎性细胞浸润，而癌旁组织结构完整，较少见炎性细胞浸润，未见或少见IL-9阳性细胞浸润。癌组织中IL-9阳性细胞高浸润率显著高于癌旁组织，并且其浸润程度与临床分期、区域淋巴结转移密切相关，III-IV期患者IL-9阳性细胞高浸润率为100%(14/14)%，显著高于I-II期患者72.2%(13/18)%，区域淋巴结转移是喉鳞状细胞癌患者重要的术后不利预后因素^[9]，我们的研究发现，癌组织IL-9阳性细胞浸润程度与区域淋巴结转移状况也有关，有转移患者癌组织IL-9阳性细胞高浸润率为100%(13/13)，显著高于无转移者73.68%(14/19)。以上结果提示IL-9可能作为喉鳞状细胞癌患者肿瘤微环境中抗肿瘤免疫的抑制性细胞因子而参与了肿瘤组织与免疫系统之间的相互作用，IL-9的高表达可能与喉鳞状细胞癌的发生发展有密切关系。
本研究结果表明喉鳞状细胞癌患者外周血Th9细胞比例及血浆中IL-9水平显著升高，且与临床分期等病理指标明显相关，提示Th9细胞及IL-9参与喉鳞状细胞癌的发生发展。
参考文献                        
[1] Kaplan M H. Th9 cells: differentiation and disease[J]. Immunol Rev, 2013, 252(1): 104-115.
[2] Lu Y, Hong S, Li H, et al. Th9 cells promote antitumor immune responses in vivo[J]. J Clin Invest, 2012, 122(11): 4160-4171.
[3] Kuang D M, Peng C, Zhao Q, et al. Activated monocytes in peritumoral stroma of hepatocellular carcinoma promote expansion of memory T helper 17 cells[J]. Hepatology, 2010, 51(1): 154-164.
[4] Veldhoen M, Uyttenhove C, Van Snick J, et al. Transforming growth factor-beta 'reprograms' the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset[J]. Nat Immunol, 2008, 9(12): 1341-1346.
[5] Dardalhon V, Awasthi A, Kwon H, et al. IL-4 inhibits TGF-beta-induced Foxp3+ T cells and, together with TGF-beta, generates IL-9+ IL-10+ Foxp3(-) effector T cells[J]. Nat Immunol, 2008, 9(12): 1347-1355.
[6] 封丽丽, 刘新, 王夏炜, 等. B细胞非霍奇金淋巴瘤患者肥大细胞及IL-9表达水平及其意义[J]. 中华血液学杂志, 2013, 34(10): 851-856.
[7] Catalano V, Turdo A, Di Franco S, et al. Tumor and its microenvironment: a synergistic interplay[J]. Semin Cancer Biol, 2013, 23(6 Pt B): 522-532.
[8] 黄晓明, 练磊, 吴小剑, 等. 结直肠癌肝转移与肿瘤微环境关系的研究进展[J]. 中华实验外科杂志, 2011, 28(11): 2018-2019.
[9] 张海利, 王旭峰, 温树信, 等. 肿瘤转移相关基因1在喉鳞癌侵袭转移中的作用[J]. 中华实验外科杂志, 2011, 28(2): 301-303.