摘要：目的 探讨miR-146a在大肠癌及结直肠息肉患者中的表达及意义。方法 收集本院49例大肠癌患者，37例结直肠息肉患者和30例健康志愿者的血清，应用 Taqman荧光定量PCR方法检测miR-146a在三组中的表达及治疗后的水平，酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定癌胚抗原（CEA）。分析miR-146a在三组中表达的差异以及大肠癌不同临床病理特征的组间差异。结果 大肠癌组miR-146a为38.12±3.56，高于结直肠息肉组和对照组，差异具有统计学意义（P< 0.05）。在有淋巴结转移的大肠癌患者中miR-146a表达水平明显高于没有淋巴结转移的患者（P< 0.05），Dukes 分期中的C-D患者中miR-146a表达水平高于A-B期患者（P< 0.05），在不同年龄组及性别组的表达水平上面无明显差异（P> 0.05）。治疗后大肠癌细胞miR-146a表达和CEA结果分别为33.40±2.98和5.32 ±0.48μg/L，均低于治疗前38.12±3.56和6.68±0.67μg/L，差异具有显著性（p＜0.05）。结论 miR-146a在大肠癌患者血清中呈高表达，治疗后明显降低，可能在大肠癌的发生、发展中发挥作用并成为大肠癌新的肿瘤标志物。
关键词：miR-146a；大肠癌；直肠息肉；癌胚抗原（CEA）
 
The expression and clinical significance of MiR-146a in colorectal cancer and colorectal polyps
Abstract: Objective To investigate the expression and significance of miR-146a in colorectal cancer and colorectal polyps in patients. Methods The study was separated three groups as follow: 49 colorectal cancer cases of patients; 37 cases of colorectal polyps patients; 30 healthy volunteers. And then Taqman real-time PCR was used to detect the expression of miR-146a in the three groups’ blood serum，and the expression of miR-146a after treatment. carcinoembryonic antigen (CEA) was determinate by Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and different clinicopathological features of colorectal cancer group differences. Results The colorectal cancer miR-146a was 38.12 ± 3.56, higher than that of colorectal polyps group and control group, the difference was significant statistically (P< 0.05). The lymph node metastasis miR-146a expression levels with colorectal cancer were significantly higher than without lymph node metastasis (P <0.05), Dukes staging of C-D patients miR-146a expression levels higher than A-B patients (P <0.05), no significant difference with different age groups and gender groups above. After treatment, the expression of miR-146a and CEA were 33.40 ± 2.98 and 5.32 ± 0.48μg/L, was lower than before treatment (38.12 ± 3.56 and 6.68 ± 0.67μg/L), the difference was significant (P < 0.05).Conclusion miR-146a was highly expressed in the serum of patients with colorectal cancer and decreased significantly after treatment. It might play a role in the incidence of colorectal cancer, colorectal cancer development and become a new tumor markers.
Key words：miR-146a ; Colorectal cancer; Colorectal polyps; Cell proliferation activity
 
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，流行病学调查发现，目前全球大肠癌的发病率为1.2亿，每年死于该病的人数达到6千多万，随着我国人均寿命的明显改善，以及人口老龄化并逐渐加重的趋势进一步明显，大肠癌的发病率也在逐年攀升，在中国的发病率也占到第3-4位[1]。目前大部分结肠癌患者没有特定预测疾病的危险因子，早期诊断具有重要意义，因此各种针对大肠癌早期诊断标志物的研究的长期热点之一。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一类长度为 20～24个核苷酸的非编码小分子RNA, 主要通过与靶基因 3’端非编码区发生不完全配对, 从而抑制靶基因 mRNA翻译^[2], 与肿瘤的发生、转移、耐药等病理进程密切相关^{[ 3]}。而且miRNA 在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性^[4]。目前已有研究证实，miR-146a在胰腺癌、宫颈癌及前列腺癌中表达异常^[5]，但是miR-146a在结直肠息肉及大肠癌的发生发展中作用机制，还没有文献报道。本研究通过检测大肠癌及非癌变患者外周血中miR-146a的表达，探讨其在大肠癌中的表达变化与临床病例特征的关系，为大肠癌的早期发现提供新的理论依据。
1.资料与方法
1.1临床资料  本研究选取本院2012年7月-2013年8月收治的49例大肠癌患者，37例结肠息肉患者，30例健康志愿者的血液来自本院体检中心。大肠癌患者中男27例，女22例，年龄31-76岁，平均56岁；结直肠息肉患者中男21例，女16例，年龄28-71岁，平均55岁；健康志愿者作为对照组，其中男18例，女12例，年龄26-60，平均年龄51岁；样本采集在大肠癌患者放化疗或手术治疗前后。
1.2 试剂与仪器  实时荧光定量PCR仪器为ABI 7500 PCR扩增仪 (PE Applied-Biosystems)。试剂盒为TAQMAN UNIVERSAL MMIX II，Taqman MicroRNA Assays(Invitrogen Life Technologies)；总RNA提取试剂盒mirvana PARIS 40rxns(Invitrogen Life Technologies)；逆转录试剂盒Taqman microRNA RT kit 200rxns(Invitrogen Life Technologies)，所有引物均有Invitrogen Life Technologies合成。
1.3 RT-PCR法测定miR-146  （1） RNA提取  新鲜血清总RNA 进行提取。在625μL血浆中加入625μL Denatueing Solution试剂，混匀，冰水浴5分钟。加入625μL的酸化氯仿，混匀30秒，再离心5分钟。小心吸取上层的液体到新的管中。取上清液体300μL，再加入100%乙醇100μL，混匀。倒入过滤子弹头中。离心30秒，收集滤液。在400μL滤液中加入266μL100%乙醇，混匀。离心30秒，倒掉滤液。再过滤管中加入700μLWash solution1 试剂，离心15秒，倒掉滤液。加入500μLWash solution2/3试剂，离心15秒，倒掉滤液，更换滤管。加入100μLElution solution 试剂在滤管中，离心30秒。紫外线分光光度计检测A260/A280的比值，进行琼脂糖电泳，检测提取样品的质量。将提取的RNA 保存在-20摄氏度的冰箱中。（2）miR-146a逆转录反应  将提取的血浆中小RNA进行反转录，选择OD260/280 值在1.6~2.1 之间的总RNA 标本。每次反应总RNA 量为100 ng。miR-146a反转录引物（ID 000468 货号4427975 ，Invitrogen Life Technologies）和内参miR-423 RNA反转录引物(ID 0002340货号4427975 ，Invitrogen Life Technologies)后，得到miR-146a及miR-423 RNA的cDNA，进行反转录反应。反应在ABI7500仪器上进行。配置反应液的所有操作均在冰上进行。  反应体系：100mM dNTPs， 0.15μL；逆转录酶50U/μL，1.00μL；10×逆转录缓冲液，1.5μL；RNase inhibitor，20U/μL，0.19μL；去离子水，4.16μL，总体积7μL。反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。（3）Taqman荧光定量PCR检测 采用相对定量法对定量结果进行分析比较，应用miR-423 RNA作为内参。应用上述TaqMan MicroRNA Assays 试剂盒中的PCR 引物探针混合液进行PCR 扩增及荧光检测。在ABI7500PCR仪上进行反应。反应体系: Taqman Small RNA Assay：1μl；cDNA；1.33μl； Taqman universed PCR Master mixⅡ：10μl；去离子水：7.67μl，反应体积20μl。反应条件：95 ℃ 10min; 95 ℃ 15 s ,60 ℃ 1 min(50个循环)。在相对定量分析中，荧光定量PCR 的结果以Ct 值显示。Ct 值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环数，Ct 值越大，表达量越低。首先计算3 个平行反应的平均Ct 值，ΔCt 等于目的基因的Ct值减去内参基因的Ct 值。用2﹣ΔΔCT(ΔΔCt=处理组平均ΔCt– 对照组平均ΔCt) 来计算表达差异的倍数。用2﹣ΔΔCt 表示目的基因相对表达量。
1.4 癌胚抗原（CEA）检测  将大肠癌患者患者治疗前应用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测血清CEA水平。
1.5 统计分析  使用SPSS17.0 统计分析软件，结果采用 ±S 表示，组间差异采用成组t 检验，组内差异采用配对t检验。P <0.05 为差异有统计学意义。

2. 结果  
   2. 各组miR-146a表达结果比较 本次实验结果显示，大肠癌组miR-146a为38.12±3.56，高于结直肠息肉组和对照组，差异具有统计学意义（P< 0.05），结直肠息肉组和对照组比较无统计学差异(P> 0.05)。各组 Taqman荧光定量PCR检测结果见表1和图1。

表1  各组miR-146a表达结果比较（ ±S）

组别	n	miR-146a
对照组		27.33±2.93
结直肠息肉组	49	29.20±3.04
大肠癌组	49	38.12±3.56▲

^▲与对照组和结直肠息肉组比较，差异有显著性(P<0.05)
 

图1 miR-146a在大肠癌及结直肠息肉中的表达 
2.2 miR-146a表达与大肠癌患者临床病理参数关系  miR-146a在已发展到淋巴结转移的大肠癌患者中的表达水平明显高于没有淋巴结转移的患者（P< 0.05），Dukes 分期中的C-D患者miR-146a表达水平高于A-B期患者（P< 0.05），在不同年龄组及性别组的表达水平上面无明显差异（P> 0.05），见表2。
表2 大肠癌患者的临床病例参数与miR-146a表达的关系

组别	例数	miR-146a的表达	P
性别	49
男	27	39.17±4.06	0.319
女	22	37.44±7.32
年龄	49
≦51	17	38.08±1.73	0.447
>51	32	36.89±8.77
淋巴结转移	49
有	28	42.39±5.49	0.026
无	21	35.33±6.19
Dukes 期	49
A-B	18	36.17±0.61	0.039
C-D	31	41.09±7.11

2.3 治疗前后大肠癌细胞miR-146a表达和CEA结果比较  本次实验结果显示，治疗后大肠癌细胞miR-146a表达和CEA结果分别为33.40±2.98和5.32 ±0.48μg/L，均低于治疗前38.12±3.56和6.68±0.67μg/L，差异具有显著性（p＜0.05）。见表3。
表3  治疗前后大肠癌细胞miR-146a表达和CEA结果比较（ ±S）

组别	n	miR-146a	CEA（μg/L）
治疗前	49	38.12±3.56	6.68±0.67
治疗后	49	33.40±2.98▲	5.32 ±0.48▲

^▲与治疗前比较，差异有显著性(P<0.05)
3 讨论     miRNA在基因转录后通过与mRNA的互补结合来调节mRNA的翻译或降解，对人类30%的蛋白表达起到调节作用。有研究表明miRNA与肿瘤的发生和发展紧密相关，在肿瘤组织中有着与正常组织不一样的miRNA表达谱征，不同的肿瘤中其miRNA的表达谱征也不尽相同^[6]。外周血肿瘤标志物的检测具有检查方便，创伤小，患者易于接受，适合于大规模的普查等多项优点, 是肿瘤诊断和随访的理想检测手段^[7]，因此通过测定外周血中肿瘤标志物的含量，对于肿瘤的治疗诊断，尤其是早期诊断意义重大。 
    Szafranska用基因芯片方法研究表明胰腺导管细胞癌miR-146a表达比正常胰腺组织高六倍^[8]；Wang X等研究发现在宫颈癌中miR-146a的表达明显升高，转染miR-146a可以促进宫颈癌细胞增殖^[9]；而在前列腺癌中miR-146a表达下调，转染外源性miR-146a可以使前列腺癌细胞细胞增殖变慢，侵袭和转移能力降低^[10]，因此，miR-146a在不同肿瘤中所起的作用是不一致的。本次研究显示，miR-146a大肠癌患者外周血中的表达明显高于结直肠息肉患者和对照组，因此miR-146a在大肠癌患者中可能起到癌基因的作用。主要由于miRNA能够调节其他与肿瘤侵袭或转移相关的基因，开启相关的癌基因或沉默相应的抑癌基因，导致肿瘤的侵袭能力或转移活性升高^[4]。本研究结果表明，miR-146a在已发展到淋巴结转移的大肠癌患者中的表达水平明显高于没有淋巴结转移的患者（P<0.05），Dukes 分期中的C-D患者miR-146a表达水平高于A-B期患者（P< 0.05）。因此，miR-146a的高表达可能促进了大肠癌的转移。CEA是一种糖类蛋白质，临床常用于消化道恶性肿瘤辅助诊断^[11]，大肠癌患者治疗后CEA明显下降，对大肠癌患者治疗后miR-146a检测可见，治疗后miR-146a表达水平明显下降，与CEA水平结果相一致。进一步提示miR-146a高表达促进大肠癌的发生。
 综上所述，miR-146a在大肠癌患者中表达上调可能与大肠癌的发生发展有关。本研究获取的样本量较少，一些确切的结论需要更多的样本进一步研究证实，另外，关于miR-146a的表达水平与大肠癌之间的机制，也需要进一步研究。
   
参考文献：
[1].Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90
[2].Esquela-Kerscher A, Slackf  J. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[ J]. Nat Rev Cancer, 2006, 6(4): 259-269
[3].Lu J, Getz G, Miska EA, etal. MicroRNA expression profiles classify human cancers[ J]. Nature, 2005, 9(435): 834-838
[4]. Buchsbaum DJ, Croce CM. Will detection of microRNA biomarkers in blood improve the diagnosis and survival of patients with pancreatic cancer? [J].JAMA,2014 ,311(4):363-365
[5].Manikandan J, Aarthi J, Kumar SD, etal. Oncomirs:The potential role of non-coding microRNAs in understanding cancer[J]. Bio information, 2008, 2(8): 330-334
[6]. Liu J, Sun H, Wang X,et al.Increased Exosomal MicroRNA-21 and MicroRNA-146a Levels in the Cervicovaginal Lavage Specimens of Patients with Cervical Cancer[J].Int J Mol Sci,2014,15(1):758-773
[7].王维林, 白鑫, 屠红. 肝癌血清标志物研究的新进展[ J].肿瘤, 2009, 29(4): 389-393
[8].Kobayashi E, Satow R, Ono M,et al.MicroRNA Expression and Functional Profiles of Osteosarcoma[J].Oncology,2014,86(2):94-103
[9].Song J, Bai Z, Zhang Z.MicroRNAs are implicated in the initiation and progression of gastric cancer [J].Chin Med J (Engl),2014,127(3):554-549
[10].Schultz NA, Dehlendorff C, Jensen BV,et al. MicroRNA biomarkers in whole blood for detection of pancreatic cancer[J].JAMA,2014,311(4):392-404
[11].谷学军，秦望森，许金玲.血清GA125联合CA19-9及CEA检测应用于大肠癌诊断的临床价值[J].中国实验诊断学,2012,16(6):1047-1049