摘要：目的：分析流式细胞术（FCM）对非小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，NSCLC）胸腔积液脱落细胞的诊断价值。方法：荧光标记特异识别NSCLC的单抗NJ001，找到NSCLC胸腔积液的FCM检测法。选择有胸腔积液的NSCLC病人64例作为癌变组，良性积液病人52例作为对照组，FCM法进行NSCLC脱落细胞水平检测，进行组间差异分析，制作ROC曲线；比较癌变组标本巴氏法和FCM法结果。直接免疫荧光测定44例NSCLC积液病人脱落细胞NJ001表达情况，并与FCM法结果相比较。结果：(1)肺部良性病变组FCM检测阳性计数水平6(0～19)个/10万，明显低于NSCLC组100(3～989)个/10万 (Z=-5．758，P<0．001)；ROC面积为0．934；其中19个/10万为最佳临界诊断值，此时特异度为100％(52/52)，灵敏度87．5％(56/64)；(2) FCM法检测的58例肺腺癌胸腔积液阳性率为93．1％(54/58)，较巴氏染色法阳性率58．6％(34/58)明显升高，有显著差别(χ²=7．736，P=0．004), 巴氏染色法检测阴性的24例NSCLC胸腔积液标本，FCM法阳性率为91.67%（22/24）。6例肺鳞癌胸腔积液标本巴氏法检测均为阴性，FCM法阳性率为33.3%(2/6)；（3）44例NSCLC胸腔积液涂片进中，FCM法阳性检出率是90．9％(40/44)，明显高于直接荧光法59．2％(26/44)，有显著差别 (χ²=4．741，P=0．028)。结论：荧光标记NJ001建立的FCM术对NSCLC的胸腔积液脱落细胞检测，特异度和灵敏度均很高，临床意义重大。
关键词：非小细胞肺癌，胸腔积液，流式细胞术
A study on the detection of cancer cells in pleural effusion by flow cytometry for non-small cell lung cancer
Abstract Objective: To discuss the clinical value of flow cytometry  established by specific fluorescent monoclonal antibody in detecting lung cancer cells in pleural effusion with non-small cell lung cancer.Methods：The FCM assay was established by using fluorescent monoclonal antibody NJ001 which could specifically recognize NSCLC．To evaluate the level of lung cancer cells in pleural effusion among 64 cases of NSCLC(including 6 lung squamous cell carcinoma cases and 58 lung adenocarcinoma eases)and 52 cases of benign disease with definite diagnosis was collected．The results of FCM assay between NSCLC and benign disease were evaluated by Statistics Software．The data were analyzed by receiver operating characteristic curve to assess the diagnosis value．Those Papanicolaou staining results among 64 cases of NSCLC were compared with FCM by the Statistics Software．Meanwhile NJ001 specific antigen on exfoliate cells was detected by direct immunofluorescence assay and comparing with FCM assay by Statistics Software among 44 cases of NSCLC．Results: (1)The number of positive counts by FCM assay was 100(3-989)/100 000 in pleural effusion of NSCLC，and 6(0-19)/100 000 in benign pleural effusion which was significantly less compared with NSCLC (Z=-5．647，P<0．001)．The area under the receiver operating characteristic curve was 0．934 and the optimal diagnostic critical value was l 9/100 000．At this point the specificity was 100% (52/52), sensitivity was 87.5% (56/64);(2) 58 cases of lung adenocarcinoma pleural effusion positive rate of FCM assay of 93.1% (54/58), compared with the positive rate of Pap 58.6% (34/58) was significantly increased, the difference was statistically significant (χ2 = 7.736, P = 0.004), Pap staining negative for 24 cases of NSCLC pleural effusion specimens, FCM method positive rate of 91.67% (22/24). 6 cases of lung squamous cell carcinoma pleural effusion specimens were negative Pap assay, FCM method positive rate was 33.3% (2/6);(3) 44 patients with NSCLC pleural effusion smear testing, which FCM method positive rate was 90.9% (40/44), significantly higher than the 59.2% direct fluorescence spectrometry (26/44), the difference was statistics significance (χ2 = 4.741, P = 0.028). Conclusion: FCM specific fluorescent antibody-labeled cytometry off NSCLC pleural effusion cells, especially lung cancer, with a high specificity and sensitivity, which was certified to be a more important clinical significance.
Keywords: non-small cell lung cancer, pleural effusion, flow cytometry
胸膜腔内液体的渗出及再吸收为一种动态平衡，任何导致液体重吸收减少或渗出增加的因素，如感染、结核等良性疾病或肺癌等恶性疾病均可导致胸膜腔内液体聚集，形成积液^[1~3]。相关报道^[4]，约50％肺癌病人在疾病进展中存在胸腔积液。NSCLC出现胸腔积液患者预后及治疗方案较肺部良性病变完全不同，故早期确诊胸腔积液性质意义重大。恶性积液的常规脱落细胞检测阳性率仅32％～72％，特异度及灵敏度均差强人意^[5，6]。找出一种便捷、准确、实用的恶性胸腔积液确诊方案是临床一大难题。多项研究表明^[7~10]，单克隆抗体NJ00l可以特异性识别NSCLC，且对NSCLC的癌组织及细胞株均有特异性反应；通过荧光标记NJ001单抗，获得外周血NSCLC特异性循环肿瘤细胞FCM法特异度和灵敏度均很高，为一种新的非小细胞肺癌标志物^[7]。我们通过对单抗NJ001进行荧光标记，获得一种便捷、准确、实用的新NSCLC胸腔积液脱落细胞FCM细胞定量术，报道如下。
1资料与方法
1.1病例资料：选取2014年2月~2015年8月期间我院我科室收治的NSCLC胸腔积液患者64例作为癌变组，所有患者均通过临床表现、病史、辅助检查及病理学诊断确诊^[1]。64例NSCLC胸腔积液患者中，58例肺腺癌、6例肺鳞癌；其中病理分期为：Ⅳ期56例，Ⅲ期8例；女26例，男38例；平均年龄为65±3.4岁，24～85岁。收集肺部良性病变导致胸腔积液患者52例作为对照组，包括22例结核性胸膜炎患者，30例其他肺部良性感染疾病患者，其中女16例，男36例，平均年龄66±3.6岁，23~86岁。本次研究获得本院伦理委员会批准，所有研究参与者都签署了知情同意书。

1.2 试剂与仪器：流式细胞仪购自BD公司（美国）；Olympus公司（日本）的倒置荧光显微镜；ThermoFisher Scientific公司(美国)Varistain Gemini自动染色仪和配套试剂；Biotium公司(美国)的MixnStain  CF^TM 488A抗体标记盒；BD公司(美国)溶血剂；Gibco公司(美国)的胎牛血清，RPMI1640；江苏省实验诊断学实验室的单克隆抗体NJ00l；中国科学院细胞库的人胚肺成纤维细胞系（HFL细胞）和人肺癌细胞系（SPC-A1细胞）。

1.3细胞培养：HFL细胞和SPC-A1细胞均置于含链霉素（100mg／L）、青霉素（100U/ml）及胎牛血清（10％）的培养液中，恒温箱中（37℃）培养。
1.4 采集标本：在临床上获得胸腔积液标本，通过200目筛网获得滤液，计算有核细胞在滤液中的浓度，然后收集含1×10⁶个有核细胞（依据有核细胞浓度收集）的滤液进行FCM检测。获取10ml滤液，离心后予以沉渣2滴涂片，干燥，固定（95％酒精），予以直接荧光检测。不能立即检测者，先置于冰箱（一20℃）保存。
1．5标记荧光抗体：严格根据试剂盒提示步骤进行荧光抗体标记，向反应柱中加入20ul的NJ001单抗(5mg/L)，离心3min（4℃，16000×g），分离并去除离心出来的液体；将PBS重悬抗体100ul加入反应柱中，取10×反应液10ul与90ul抗体混合均匀；以上液体都转到荧光染料中混合均匀，反应30min；向储液管中置入反应后的液体并混合均匀，分装（离心管），保存（避光，-20℃）。
1．6 建立FCM检测术：在1ml HFL或SPC-A1细胞中（1×10⁶/ml）加入5ul 特异性NJ001（荧光标记），反应20min；加入PBS液2ml，400×g，离心5min，摒弃上清，操作重复2次；再向其中加入PBS重悬细胞1ml。取含1×10⁶个有核细胞的滤液量（按照胸腔积液滤液有核细胞浓度计算），加入PBS液2ml，400×g，离心5min，摒弃上清，操作重复2次，再向其中加入PBS液100ul，振荡后加入NJ001（荧光标记）5ul，反应20min；加人2ml溶血剂，反应10min；加入PBS液2ml，400×g，离心5min，摒弃上清，操作重复2次，再加入1ml重悬细胞。流式仪各自测定标记后的良性积液有核细胞(溶血后)、HFL细胞和SPC-A1细胞各10万个，依据NJ001特性设定阳性门和阴性门。对52例良性积液和64例NSCLC积液各自用流式仪测定10万个细胞，获得NJ001阳性的细胞个数，即胸腔积液非小细胞肺癌脱落细胞水平，以个/10万来表示。
1．7 巴氏染色测定脱落细胞：向50ml离心管加入40ml胸腔积液，2100×g，离心10min，摒弃上清液，取2滴沉渣进行涂片，干燥，固定（95％酒精），染色仪染色后进行镜检。由本院病理学实验室完成巴氏染色检测。
1．8 直接荧光法测定NJ001：将待测胸腔积液脱落细胞、HFL细胞、SPC-A1细胞分别涂片并平衡至室温，每片滴加100ul荧光抗体(1：200)，孵育30min（37℃），PBS洗5次，滴20ul甘油进行封片，倒置荧光显微镜下立即观察结果。
1.9 统计学方法：采用SPSSl7．0软件进行数据分析。计量资料进行正态性检验，偏态分布数据之间的比较采用秩和检验；技术资料采用χ²检验，不满足χ²检验条件者采取Fisher确切概率法，以P<0．05为有显著差别。
2结果
2.1建立非小细胞肺癌胸腔积液脱落细胞的 FCM检测
本研究通过特异性荧光抗体标记的FCM检测发现，NJ001阳性表达细胞（SPC-A1）荧光强度明显高于阴性表达细胞（良性积液及HFL细胞）。根据NJ001在良性积液、HFL和SPC—A1细胞中表达设定FCM检测的阳性和阴性门。将特异性荧光抗体NJ001加入1×10⁶个阴性对照的良性胸腔积液有核细胞和HFL细胞、阳性对照SPC—A1细胞处理后，经FCM检测1×10⁵个细胞，获得阳性计数分别为0．0％、0．6％、98．3％。（见图A）
 
  
注：图1、2、3显示未加入荧光抗体的SPC-A1、HFL、良性积液细胞FCM检测结果；图4、5、6显示加入荧光抗体的SPC-A1细胞、HFL细胞和良性胸腔积液有核细胞的FCM检测结果。
图A.特异性荧光抗体标记的FCM术
2.2非小细胞肺癌胸腔积液脱落细胞FCM检测术的意义
对116例胸腔积液脱落细胞标本进行荧光标记NJ001的 FCM检测，其中良性组阳性水平为6(0～19)个/10万，明显低于NSCLC组100(3～989)个/10万，差异有统计学意义 (Z=-5．758，P<0．001)。以116例标本的FCM检测结果作ROC曲线，获得曲线下面积为0．934(95％可信区间[0．835,0．983]，标准误为0．029)；其中最佳临界诊断值为19个/10万，此时特异度为100％(52/52)，灵敏度87．5％(56/64)，见图B。
 
图B：FCM检测NSCLC脱落细胞水平的ROC曲线
2.3 NSCLC胸腔积液脱落细胞FCM法与巴氏法比较
以19个/10万这一最佳临界诊断值作为判断标准，64例非小细胞肺癌胸腔积液脱落细胞的FCM检测阳性率为87．5％(56/64)，明显超过巴氏检测法（阳性率53．1％(34/64)），具有显著差别（ χ²=7．649，P=0．004)，见表1。其中FCM法检测的58例肺腺癌胸腔积液脱落细胞阳性率为93．1％(54/58)，较巴氏染色检测法阳性率58．6％(34/58)明显升高，具有显著差别(χ²=7．736，P=0.004)。巴氏染色法检测阴性的24例NSCLC胸腔积液脱落细胞标本，FCM检测法阳性率为91.67%（22/24）。6例肺鳞癌胸腔积液脱落细胞巴氏法检测均为阴性，FCM检测法阳性率为33.3%(2/6)。
 
2.4基于NJ001特异性抗原建立的直接荧光法对NSCLC胸腔积液细胞检测结果
基于荧光标记的NJ00l建立的直接荧光法对NSCLC胸腔积液脱落细胞检测，将测定的HFL和SPC-A1细胞作为标准：HFL细胞上没有明显阳性信号，SPC-A1细胞在胞膜上和胞浆中均有阳性信号表达，阳性对照细胞荧光信号显著高于阴性对照细胞（见图C.1—4）.
直接荧光法进行NSCLC胸腔积液涂片检测（见图C.5-8）。直接荧光法对NSCLC胸腔积液脱落细胞检测的阳性率为59．2％(26／44)；相应巴氏检测法和FCM法的检出率分别为63．7％(28／44)、 90．9％(40／44)。其中直接荧光法与巴氏染色检测法相比较，阳性率没有显著差别(χ²=0．191，P=0.661)；FCM检测法阳性率明显高于直接荧光法，差异有统计学意义(χ²=4．741，P=0．028)；并且FCM检测法阳性率高于直接荧光法与巴氏染色法联合检测86．3％(38／44)；FCM检测法、直接荧光法和巴氏染色法联合检测的阳性率为95．5％(42／44)。
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注：（1）图1和图2分别为光学显微镜下和荧光显微镜下SPC-A1细胞，图3和图4分别为光学显微镜下和荧光显微镜下HFL细胞；（2）图5为肺腺癌胸腔积液脱落细胞（光学显微镜下），图6为NJ001阳性表达的肺腺癌胸腔积液脱落细胞(荧光显微镜下)；图7为良性积液脱落细胞（光学显微镜），图8为良性积液脱落细胞 (荧光显微镜)。
图C. NJ001特异性抗原在胸腔积液脱落细胞中表达的直接荧光法
（荧光染色×400）
3讨论
NSCLC约占肺癌的80％，大多数患者确诊时已经到了晚期，5年平均生存率不到16．8％，预后较差^[11]。胸腔积液是晚期NSCLC的常见并发症，因而早期确诊胸腔积液性质对于NSCLC的诊断治疗意义重大。
传统的包括瑞氏染色法、巴氏染色法及HE染色法等在内的脱落细胞学涂片染色仍是目前临床上主要的检测方法。尽管这些方法快捷简单，但阳性检出率低，较易出现漏诊现象；同时诊断的准确性和病理医师经验、涂片细胞的瘤化期(如瘤化早期、极早期)、染色的质量、镜检细胞数量、细胞变异等的主观因素相关。由于巨噬细胞和间皮细胞可引起干扰，常导致假阳性出现，在一定程度上造成误诊。尽管近年来细胞切片检测技术的出现和自动化处理系统应用于脱落细胞染色使传统的涂片染色法阳性率升高，然而仍难以满足临床需求^[12,13]。
我们通过荧光标记能特定识别NSCLC单抗NJ001，获得了NSCLC胸腔积液脱落细胞FCM细胞定量检测法。通过检测116例患者的胸腔积液标本发现，非小细胞肺癌胸腔积液脱落细胞FCM检测的阳性率明显高于良性病变。64例非小细胞肺癌胸腔积液脱落细胞FCM检测阳性率为87．5％(56／64)，明显超过巴氏染色法（阳性率53．1％(34/64)）；其中FCM法检测的58例肺腺癌胸腔积液脱落细胞阳性率达到93．1％(54/58)，巴氏法检测阴性的24例NSCLC胸腔积液脱落细胞标本，FCM检测法阳性率为91.67%（22/24），这表明FCM法敏感度很高。这与韩月等人^{[14 ]}，研究结论一致。其中6例肺鳞癌胸腔积液脱落细胞巴氏法检测均为阴性，FCM检测法阳性率也仅为为33.3%(2/6)。肺鳞癌病人出现胸腔积液的一般很少，尚需进一步扩大肺鳞癌病人的标本量来探索其检测阳性率。在直接荧光法我们可以看到，在NSCLC细胞胞膜及胞浆上均有NJ001表达，而肺部良性病变胸腔积液脱落细胞上没有见到明显表达的阳性信号，这表明FCM法特异度也很高。
  本实验建立的NSCLC胸腔积液脱落细胞FCM细胞定量检测法运用FCM检测，克服了巴氏染色法检测者经验因素、待检细胞是否为典型形态、制片染色繁琐、较高(50～100 m1)标本量^[15]要求等问题，且容易标准化。NSCLC胸腔积液FCM术具有极高的特异度和灵敏度，FCM法的检出阳性率较直接荧光法联合巴氏染色法检测阳性率高，同时FCM法仅需lO ml左右的胸腔积液标本量(10⁶个有核细胞)，测定有核细胞10万个，即可获得诊断依据。
综上所述，荧光标记NJ001建立的FCM术对NSCLC尤其是肺腺癌的胸腔积液脱落细胞检测，特异度和灵敏度均很高，临床意义重大。为NSCLC晚期且胸腔积液量少、活检多次仍不能确诊及无法耐受活检患者者提供了一个有效诊断方法。
参考文献：
[1] 俊俊，徐兴祥，闵凌峰，等．免疫磁珠阴性法富集恶性胸腔积液中肿瘤细胞方法的建立[J]．中华结核和呼吸杂志，2012，35(9)：673-678．
[2]Liang QL，Shi HZ，Qin XJ，et a1．Diagnostic accuracy of tumour markers for malignant pleural effusion：a meta-analysis[J]．Thorax，2008，63(1)：35-41.
[3] 谢力，李鸿钧，孙茂盛．单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用进展［J］．国际免疫学杂志，2012，35（6）：445－452.
[4] 灵芝，赵平．中国肿瘤死亡报告-全国第三次死因回顾抽样调查[M]．北京：人民卫生出版社，2010：35．
[5]Wender R，Fontham ET，Barrera E Jr，et a1．American Cancer Society Lung Cancer Screening Guidelines[J]．CA Cancer J Clin，2013，63(2)：107-117．
[6]Park DS，Hwang KE，Shim H,et a1.Elevated survivin is associated with a poor response to chemotherapy and reduced survival in lung cancer with malignant pleural effusions[J]．Clin Exp Metastasis，2012,29(7)：83-89.
[7] 凌芸，王芳，朱全，等．非小细胞肺癌特异性循环肿瘤细胞的检测及其临床意义[J]．中华检验医学杂志，2013，36(11)：1002-1007．
[8]沈立松．流式细胞术的研究进展及临床应用前景[J]．中华检验医学杂志，2009，32(3)：260-262．
[9] Pan S，Wang F，Huang P，et a1．The study on newly developed McAb NJ001 specific to non-small cell Lung cancer and its biological characteristics[J]．PLoS One，2012，7(3)：e33009．
[10] 杨瑞霞，潘世扬，王芳，等良恶性胸腔积液鉴别中SP70检测的临床意义[J]中华检验医学杂志，2012，35(12)：1150-1154．
[11] Montesinos J，Bare M，Dalmau E，el a1．The Changing Pattern of Non-Small Cell Lung Cancer Between the 90th and 2000th Decades[J]．Open Respir Med．2011，5（10）：24-30.
[12] Ken S，Shian CK，Gu DL，et a1．IGDB.NSCLC：integrated geuemic database of non-small cell lung cancer[J]．Nucleic Actds Res,2011,12(7)：l-6．
[13]彭婴，潘世扬，王芳，等．非小细胞肺癌患者血清中SP70的检测及其临床意义[J]．中华检验医学杂志，2012，35(6)：554-558．
[14]韩月，王芳，徐婷，等．NJ001特异性抗原在肺腺癌中的表达及临床意义[J]．中华检验医学杂志，2013，36(10)：895-898．
[15]王加.潘世扬.张炳峰,等.特异性循环肺癌细胞流式检测参考区间的建立及在非小细胞肺癌化疗中的应用[J].中华检验医学杂志,2015,38(1):45-48.