【摘要】 目的 探讨HPV16感染的宫颈癌中微小染色体维持蛋白-5（MCM5）与P16^INK4A表达及意义。方法 实时荧光定量PCR及免疫组化测定存在HPV16感染正常宫颈、CIN I、CIN II和CIN III及鳞癌MCM5、P16^INK4A的mRNA、蛋白表达情况，分析临床意义。结果 MCM5 mRNA及蛋白在HPV16感染的不同程度宫颈病变组织中表达趋势一致，随CIN程度的增加表达增高。MCM5 mRNA及蛋白在鳞癌中表达显著较各级别上皮内病变及正常组织高（P＜0.01）。宫颈癌中MCM5 mRNA及蛋白的表达和病人年龄没有关联（P＞0.05）；与病理分级、临床分期相关（P＜0.01）。 宫颈HPV16感染不同程度病变中P16^INK4AmRNA、蛋白表达趋势一致，随CIN程度增加表达增高。P16^INK4A mRNA及蛋白在鳞癌中表达明显高于正常及CIN I组织（P＜0.01）；和CINII、CIN III没有显著差别（P＞0.05）。P16^INK4A mRNA及蛋白在宫颈癌中的表达和病人年龄及临床分期没有关联（P＞0.05）；和病理分级有关（P＜0.01）。 MCM5和P16^INK4A蛋白表达呈正相关（r=0.497，P＜0.01）。结论 宫颈癌中MCM5和P16^INK4A存在高表达，可能与其发生、进展相关。MCM5可较好的反映宫颈的恶性增生，与P16^INK4A联合检测对于完善CIN分级及预后的判断意义重大。
关键词：宫颈鳞癌；P16^INK4A；微小染色体维持蛋白5
Expression and significance of minimal chromosomal protein-5 and P16^INK4A in cervical squamous cell carcinoma with HPV16 infection
【Abstract】 objective To investigate the expression and significance of minimal maintenance protein-5 and P16^INK4A in cervical carcinoma and cervical lesions with different degrees of HPV16 infection. Method HPV16 infection of 20 cases of normal cervical tissues, 14 cases of I CIN tissue, 18 cases of II~III CIN tissue, 50 cases of cervical squamous cell carcinoma；the expression of and mRNA in MCM5 and P16INK4A were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry, and the clinical significance was analyzed. Results MCM5 mRNA and protein in HPV16 infection in different degrees of cervical lesions in the organization, the expression of the same trend, with the increase in the degree of CIN expression increased. Expression of MCM5 mRNA and protein in cervical carcinoma was significantly higher than that in normal and all levels of cervical lesions (P < 0.01). Expression of mRNA MCM5 and protein in cervical cancer was not correlated with age (P > 0.05), and was correlated with pathological grade and clinical stage (P < 0.01). The expression trends of P16^INK4AmRNA and protein in cervical lesions in different degrees of HPV16 infection were consistent, and the expression increased with the increase of CIN degree. The expression level of mRNA P16^INK4A and protein in cervical carcinoma was significantly higher than that in normal and I CIN tissues (P < 0.01). There was no significant difference between CINII~III and (P > 0.05). Expression of mRNA P16^INK4A and protein in cervical cancer was not correlated with age and clinical stage (P > 0.05), and was correlated with pathological grading (P < 0.01). Expression of MCM5 protein and P16^INK4A protein in cervical squamous cell carcinoma was positively correlated (r=0.497,P < 0.01). Conclusions There is high expression of MCM5 and P16INK4A in cervical carcinoma, which may be related to the occurrence and progression of cervical cancer. MCM5 can be a better reaction of cervical malignant hyperplasia, and P16INK4A joint detection for the improvement of CIN classification and prognosis of the significance of the judgment.
【Key words】cervical squamous cell carcinoma; P16^INK4A; MCM5
宫颈癌为上皮内瘤变（CIN）经过一个较长过程逐渐转变而来，人乳头瘤病毒(HPV)感染在这一过程中作用重大^[1]。早期发现癌前病变中异常水平的分子标志物对宫颈癌筛查的完善意义重大。微小染色体维持蛋白5（MCM5）为DNA复制过程中发挥重要作用的蛋白，其功能的正常与否和微染色体有丝分裂稳定性关系密切，为近期肿瘤相关研究中较热的一种细胞增殖相关分子标志物^[2]。P16^INK4A和细胞周期调控关系密切，是一种抑癌基因，和肿瘤的发生、进展有关^[3]。我们通过检测不同程度宫颈病变和鳞癌中MCM5、P16^INK4A表达，探究二者在HPV16感染鳞癌发生、进展过程的作用，为完善癌前筛查及预后判断提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1一般资料 以我院2014年2月~2016年2月期间术后病理活检为宫颈鳞癌的病人50例，低度宫颈上皮内瘤病变（CIN I级）14例，高度宫颈上皮内瘤病变（CIN II~III级）18例。宫颈鳞癌病人平均年龄40.5±5.8岁，38～64岁，其中40岁及以上病人31例，小于40岁病人19例。根据国际妇产科联盟的临床分期标准^[4]：Ia期6例，Ib期12例，Ⅱa期14例，Ⅱb期18例。所有病人均确诊为HPV16单一感染，通过术后病理确诊，术前均没有放化疗及其他药物治疗。选择同时间内我院收治存在HPV16单一感染，并由于子宫脱垂住院予以子宫全切后病理结果提示正常宫颈组织病人20例作为对照组。获得组织标本后予以分为2份，一份进行甲醛溶液（100mmol/L）固定后石蜡包埋；一份冻存于液氮中。这次课题得到我院伦理委员会批准，全部病人签署知情同意书。
1.2 仪器与试剂 ABI 7500 Real-Time定量PCR仪，上海智岩科学仪器有限公司；来自博士德生物技术公司：DAB显色盒；SABC免疫组化盒；鼠抗人P16^INK4A单抗；兔抗人MCM5单抗。宝生物工程公司的产品：SYBR Premix EX Taq 实时荧光定量试剂盒；RT-PCR逆转录试剂盒；RNAiso  Plus RNA 提取剂。
1.3引物 引物设计参照相关文献^[5]，其中宝生物工程公司进行合成P16^INK4A和MCM5的引物；由上海生物工程公司合成内参β-actin。
1.4实时定量荧光PCR 
1.4.1提取总RNA与合成cDNA：取出组织样本50mg，提取总RNA（仔细根据说相关试剂明书开展），测其纯度（紫外分光法），予以A（260）/A（280）位于1.8~2.2的标本严格按照逆转录试剂盒说明书进行反转录。
1.4.2实时荧光定量PCR：ABI 7500 Real-Time定量PCR仪对MCM5 mRNA与P16^INK4AmRNA的相对表达量进行检测，根据实时荧光定量试剂盒说明书开展操作。1.5免疫组化：采用SABC法进行蛋白表达的检测。取出切片后予以脱蜡、水化、高压热抗原修复后进行免疫组化。操作过程严格根据说明书开展，阴性对照组我们采用PBS缓冲液替代一抗。
1.5统计学方法：采取SPSS18.0处理数据，以均数±标准差（）表示荧光定量结果，正态性分析发现方差不齐的资料，两组间比较采用Mann-WhitneyU秩和检验；多组间比较采用Kruskal-WallishH秩和检验；采取χ^２及Fisher确切概率法处理免疫组化资料；采取非参数秩和检验处理等级资料；Spearman秩检验进行相关性分析。以P＜0.05为有显著差别。
2结果
2.1  MCM5、P16^INK4A mRNA 在HPV16感染后不同宫颈组织的表达 以正常组织表达量为标准，mRNA的相对表达量应用2^-ΔΔct法获得。（1）MCM5mRNA的相对表达量随着宫颈病变的程度升高逐渐增加，存在显著差别（χ²＝57.141，P＜0.001）。MCM5mRNA在宫颈癌组织中表达量明显高于正常组织及各级别宫颈病变组织，均存在显著差别（χ²＝-6.589，-5.524，-4.473；P＜0.001）；在CINI组织中表达量较CINII~III组织无显著差别（χ²＝-0.107，P＞0.05）。（2）P16^INK4AmRNA的相对表达量随宫颈病变程度升高而增加，存在显著差别（χ²＝47.628，P＜0.01）。P16^INK4AmRNA在宫颈癌中表达显著高于正常组织（χ²＝-4.349，P＜0.001）；较CINII~III组织无显著差别（χ²＝-1.572，P＞0.05）。在CINI组织中表达量较正常组织无显著差别（χ²＝-1.217，P＞0.05）；较CINII~III组织有显著差别（χ²＝-3.54；P＜0.01）。
2.2  P16^INK4A、MCM5 mRNA的表达与临床特征的关系：（1）宫颈癌中MCM5mRNA的表达和年龄无关（χ^２=－0.241，P＞0.05）；与临床分期有关，MCM5mRNA表达量Ia～Ib期明显低于IIa~IIb期（χ^２=－4.93，P＜0.01）。和病理分级有关，表达量随病理分级降低而降低（χ^２=－4.017，P＜0.01）。（2）宫颈癌中P16^INK4AmRNA表达和年龄无关（χ^２=－1.079，P＞0.05）；和临床分期无关（χ^２=2.001，P＞0.05）；和病理分级有关，随着病理分级的降低而降低（χ^２=8.560，P＜0.01）。
2.3 HPV16感染后不同宫颈组织中MCM5蛋白和P16^INK4A蛋白的表达：阳性表达的MCM5蛋白定位于细胞核，为棕黄色颗粒。宫颈正常组织中无或仅为弱表达，限于基底层。随着宫颈内瘤变程度加重，阳性表达细胞升高，范围增大，染色增强，鳞癌组织呈现弥漫表达，见图1。阳性表达的P16^INK4A蛋白为棕黄染色位于细胞核(和)或胞浆中。正常组织中几乎没有表达。随着宫颈内瘤变程度加重，阳性表达细胞升高，范围增大，染色增强，鳞癌组织呈现弥漫表达，染色强阳性为主，见图1。
abcd e f
注：MCM5在不同宫颈病变组织中的表达：图a.CINI组织；图b.CIN III组织；图c.宫颈鳞癌组织。P16 ^INK4A蛋白在不同宫颈病变组织中的表达：图d.CINI组织；图e.CIN III组织；图f.宫颈鳞癌组织。
图1.MCM5和P16 ^INK4A蛋白在不同宫颈病变组织中的表达（SABCX200）
Note: Expression of MCM5 in different cervical lesions ：Figure a. CIN I organization；Figure b.CIN II organization；Figure c. Cervical squamous cell carcinoma. Expression of P16^INK4A in different cervical lesions：Figure d. CIN I organization；Figure e.CIN II organization；Figure f. Cervical squamous cell carcinoma.
Figure1. Expression of MCM5 and P16 ^INK4A in different cervical lesions（SABC,X200）
（1）在不同宫颈组织病理学改变程度增加MCM5蛋白的表达逐渐升高，差异有显著性（P＜0.01）；其中在鳞癌中表达显著高于正常及各程度瘤变组织（P＜0.05）；CINI组织较CINII~III中表达没有显著差别（P＞0.05））。（2）P16^INK4A在不同宫颈组织中表达随着病变程度升高逐渐增加，存在显著差别（P＜0.01）；在CINII~III中的表达显著高于正常组织及CINI组织（P＜0.05），较宫颈癌组织表达差别不显著（P＞0.05）。见表4.
表1. 不同宫颈组织中MCM5 与P16^INK4A的阳性表达

组别	N	MCM5						P16INK4A
		-	+	++	+++	阳性率（%）	P	-	+	++	+++	阳性率（%）	P
宫颈癌	50	1	12	23	14	98.0%c	0.021	2	7	18	23	96.0%z	0.301
CIN II~III	18	4	4	6	4	77.8%b	0.674	2	4	5	7	88.8%Y	0.006
CIN I	14	5	5	3	1	64.3%a	0.039	10	3	1	0	28.6%x	0.059
宫颈正常组织	20	17	3	0	0	15.0%	0.003	20	0	0	0	0.0%	0.000

注：采用χ^２检验及Fisher确切概率法；MCM5蛋白的表达：与正常组织比较，^aP＜0.05；与CIN I比较，^bP＞0.05；与CIN II~III比较，^cP＜0.05. P16^INK4A蛋白的表达：与正常组织比较，^xP＞0.05；与CIN I比较，^yP＜0.05；与CIN II~III比较，^zP＞0.05.
2.4 MCM5、P16^INK4A蛋白的表达与临床特征的关系：鳞癌中MCM5蛋白表达和病理分化及临床分期相关（P＜0.01）；与年龄无关（P＞0.05）。P16^INK4A的表达和病理分化有关（P＜0.05）；与临床分期及年龄无关（P＞0.05）。见表5.
表2.MCM5蛋白和P16^INK4A蛋白在宫颈癌中的表达与临床特征的关系

临床资料	N	MCM5						P16INK4A
		-	+	++	+++	χ２ （z/t）	P	-	+	++	+++	χ２（z/t）	P
年龄						0.000	1.000					-1.248	0.186
＜40岁	19	0	4	9	6			1	2	4	12
≥40岁	31	1	8	14	8			1	5	14	11
病理分化						-2.841	0.003					-2.174	0.028
低分化G3	10	0	2	7	1			1	0	1	8
中分化G2	29	0	5	11	13			1	2	12	14
高分化G1	11	1	5	5	0			0	5	5	1
临床分期						-2.784	0.004					-1.471	0.130
Ia~Ib	18	1	3	3	11			1	2	2	13
IIa~IIb	32	0	9	20	3			1	5	16	10

注：采用Mann Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验。
2.5 鳞癌中MCM5、P16^INK4A蛋白表达的相关性：采用Spearman秩相关性分析发现，宫颈癌中MCM5和P16^INK4A蛋白表达呈正相关（r=0.497，P＜0.01）。见表6.
3讨论
HPV为双链环状DNA病毒，其基因基本结构包括早、中、晚三个重要区域，其中HPV感染细胞的恶变常与早期基因区域(early  region, E)及其产物E6、E7的表达异常相关^[6]。报道显示，高危HPV持续感染状态为宫颈癌发生及进展的重要因素，HPV16则为世界公认引起宫颈鳞癌最重要基因型^[7]。因此我们选择HPV16单一感染的宫颈病变组织纳入研究，排除了多重、不同类别感染造成的干扰。由于HPV感染多较短暂，其病毒基因组尚未整合进入宿主时对HPV DNA的监测应用于癌前病变患者恶变程度判断意义有限。而MCM5和P16^INK4A均在细胞增殖过程中对其周期进行调节，因此其应用于病情进展及癌前病变的预测不受基因整合的限制，较HPV监测可能意义重大^[8]。因此我们对不同程度上皮内病变及鳞癌中MCM5、P16^INK4A表达进行了检测，对其在鳞癌发生、进展过程的作用、与临床特征的关系进行了探讨。
作为MCM家族的一员，MCM5蛋白具有高度保守性，在DNA复制过程中作用重大，被认为是一种特异能反映细胞增殖活性的分子标志物^[9]。我们的研究显示，MCM5蛋白及mRNA在低度宫颈内瘤变组织中即出现表达，其阳性表达细胞数目随着病变程度增加而上升，表达范围从基底层逐渐向表层推移，这提示MCM5的异常表达与宫颈癌的发生、浸润等过程密切相关。与相关报道^[10]，MCM5 mRNA的表达在宫颈正常组织、不同程度宫颈内瘤变、鳞癌组织中表现出线性上升，研究结果一致。而我们的研究中MCM蛋白与mRNA的表达呈现一致性，表明上调的MCM5表达与组织细胞增殖活性程度逐渐的上升具有一致性。提示MCM5可较好反映细胞增殖活性，对于正常组织、不同程度上皮内瘤变组织、鳞癌存在一定区分能力和参考意义。
本次研究中，MCM5 mRNA及蛋白在宫颈正常组织中的表达明显低于各级瘤变组织及鳞癌组织；鳞癌中的表达明显高于CINII~III。提示上调的MCM5标志着潜在恶性细胞和非典型细胞的增生，因此我们或许可以根据MCM5的表达量在一定程度上对正常宫颈组织、上皮内瘤变、恶性增生组织进行区分，可能作为癌前病变与鳞癌的新的诊断辅助指标。这与Zhang ^[11]等人研究结果相一致。
研究显示^[12]，宫颈涂片中应用MCM5抗体检测进行恶变潜能细胞的诊断其敏感性和特异性均较高。而在我们的研究中，CIN II~III宫颈内瘤变组织中MCM5蛋白及mRNA的表达较CINI均没有显著差别，因此我们认为尚不能根据MCM表达的的改变来进行宫颈内瘤变程度分级，但可以根据细胞及组织中的MCM5的表达程度来判断病变组织的恶变能力及危险性。本研究中，MCM5蛋白及mRNA表达水平和病人年龄无关，和肿瘤临床分期、分化程度相关，并随着临床分期进展及分化程度降低出现表达上升。表明肿瘤细胞恶性程度越高其增殖能力越强，进一步显示MCM5与肿瘤细胞增殖能力及恶性程度的密切关系。
P16^INK4A为一种和细胞周期调控相关的抑癌基因，其产物P16^INK4A蛋白可以通过结合CDK4/6后使CDK4/6活性下降，引起视网膜母细胞癌基因产物（PRb）磷酸化程度下调，从而抑制细胞的增殖。正常情况下，pRb聚集可抑制P16^INK4A表达，即负反馈调节作用。但HPV E7蛋白也对其存在抑制作用，因此致瘤的HPV转化细胞其调控细胞周期的pRB途径出现了紊乱^[13]。报道显示^[14]，P16^INK4A蛋白在宫颈鳞癌及癌前病变组织中的过表达和高危型HPV感染关系密切。也有研究显示^[13]，HPV中E7的高表达通过诱导CDKN2A(P16^INK4A/ ARF)位点的改变及其他触发致瘤信号途径引起P16^INK4A蛋白的过表达，而高度表达的P16^INK4A不但其生理功能缺失，还能维持致瘤HPV转换细胞的增殖。
报道显示^[15]，P16^INK4A在多数肿瘤中均不表达或低表达，但宫颈癌组织中为高表达。我们的研究显示， P16^INK4AmRNA在正常宫颈组织中未见明显表达，而在各级瘤变及宫颈癌组织中其表达量及范围随着宫颈病变的程度升高逐渐增加，与Zhang等人^[16]研究结论一致。提示高表达P16^INK4A在宫颈恶变过程作用重大，是宫颈癌早期事件。我们的研究中，在CINII~III组织组织中表达量较CINI显著上升，但较宫颈癌组织中表达无显著差异。相关报道表明^[17]，低级别瘤变组织P16^INK4A阳性表达病人较阴性易向高度上皮内瘤变发展。因此我们认为P16^INK4A的检测尽管无法对高度瘤变向恶变的进展进行预测，但在一定程度上可区分上皮内瘤变的高低程度，对上皮内瘤变的转归具有一定的预测作用，将其纳入癌前病变的诊断的分子标志物中有助于提高筛查的准确度。
我们发现，MCM5和P16^INK4A蛋白在鳞癌中表达呈正相关，表明二者在HPV16感染鳞癌发生、进展中可能存在协同作用。然而由于目前相关临床研究仍相对较少， MCM5和P16^INK4A在宫颈癌中的表达与肿瘤的发生、进展的相关性及其在宫颈癌中发挥作用的具体机制仍有待后续更进一步深入探究，这也是我们的后续研究方向。综上所述，联合检测MCM5和P16^INK4A可协助判断细胞增殖状态、上皮内瘤变程度，以及筛查出具有潜在恶性的上皮内瘤变，并对预测病情发展及CIN转归意义重大，与HPV的联合检查提高了癌前病变及宫颈癌的筛查阳性率。
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