【摘要】 目的 构建一种可用于卵巢癌诊断和术前治疗的核酸嵌合体。方法 设计一种CA125- Plk1嵌合体，PEG用来增加核酸嵌合体的稳定性；流式方法用来检测嵌合体与卵巢癌细胞的结合率；MTT用来检测嵌合体对卵巢癌细胞增殖的影响；Tunel染色来检测嵌合体对卵巢癌细胞凋亡的作用。 结果 流式的结果显示嵌合体组约有83.6%的卵巢癌细胞能够结合CA125- Plk1嵌合体，其比例与CA125抗体组类似（P＞0.05），显著的高于对照组（P＜0.05）；MTT的结果显示嵌合体组卵巢癌细胞的平均增殖率为0.32，相对于对照组和适配体分别下降了62.79%和54.93%，结果具有显著的统计学差异（P＜0.05）；Tunel染色结果显示相对于对照组，嵌合体组卵巢癌细胞凋亡的平均比例分别上升了2.29倍，差异显著，具有显著的统计学差异（P＜0.05）。结论 我们构建了一种CA125-Plk1嵌合体，其能特异性的结合卵巢癌细胞，通过抑制增殖和促凋亡，达到一个潜在的诊断和术前治疗作用。
【关键词】卵巢癌；适配体；增殖；凋亡
Construction of nucleic acid chimera for diagnosis and preoperative treatment of ovarian cancer 
【Abstract】 Objective To construct one nucleic acid chimera for diagnosis and preoperative treatment of ovarian cancer. Methods A CA125- Plk1 chimera was designed and PEG was used to increase the stability of nucleic acid chimera; flow cytometry method was used to detect ability of chimerism combining with ovarian cancer cells; MTT was used to detect the influence of chimerism on proliferation of ovarian cancer cells; Tunel staining was used to detect the effect of chimerism on ovarian cancer cell apoptosis. Results Flow cytometry showed that about 83.6% of the ovarian cancer cells in the chimera group were able to bind to the CA125- Plk1 chimera, which was similar to that in the CA125 group (P ＞ 0.05), and which was significantly higher than that in the control group (P < 0.05); The results of MTT showed that the proliferation rate of ovarian cancer cells in the chimera group was 0.32, which was decreased by 62.79% and 54.93%, respectively (P < 0.05); Tunel staining showed that compared with control group, the ovarian cancer cell apoptosis ratio in chimera group increased by 2.39 times. Conclusion We constructed a CA125-Plk1 chimera, which can specifically bind ovarian cancer cells, inhibit proliferation and promote apoptosis, reaching a potential diagnostic and preoperative therapeutic effect.
【Key words】 Ovarian cancer; aptamer; proliferation; apoptosis
卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，对妇女生命和健康造成严重威胁。卵巢癌的早期症状十分不明显，手术时局限于卵巢的比例十分低，大部分已经转移到附件或者腹腔，因此卵巢癌的死亡率占各类妇科肿瘤的首位^{[1, 2]}。卵巢癌的早期诊断和术前治疗能显著提高卵巢癌患者的短期生活质量和长期生存率，已经成为目前国内外研究的热点。适配体是通过Selex技术筛选出的一段核酸序列，能够特异性的结合靶细胞或者分子^{[3, 4]}。James等基于适配体和SiRNA，设计了一段核酸的嵌合体，适配体DNA能够特异性的结合靶细胞，之后结合的细胞内吞这段核酸序列，在胞内Dicer酶的特异性剪切下形成了SiRNA，达到基因沉默和肿瘤治疗的效果^{[5, 6]}。在本篇文章中，我们设计了一种能靶向卵巢癌细胞的嵌合体，为卵巢癌的早期诊断和治疗提供新的手段。
1 材料和方法
1.1 材料
CA125是卵巢癌特异的表面标志，适配体的序列是AAAAUGCAUGGAGCG
AAGGUGUGGGGGAUACCAACCGCGCCGUG^[7]；Plk1 siRNA 具有显著肿瘤抑制作用，其序列是AAGGGCGGCTTTGCCAAGTGC；我们参照文献报道的方法设计了CA125- Plk1嵌合体^{[5, 6]}。CA125适配体、Plk1 siRNA 和CA125- Plk1嵌合体由上海吉玛生物科技公司合成。PEG被用来增加核酸嵌合体的稳定性。
1.2细胞培养
OVCAR-3卵巢癌细胞采用含有10%胎牛血清（Hyclone）的RPMI培养基（Hyclone）中进行培养；IOSE80卵巢上皮细胞采用10%胎牛血清的DMEM/F12培养基（Hyclone）中进行培养；实验采用第三代到第五代处于对数生长期细胞。
1.3 细胞结合实验
细胞用0.25%的胰酶（Hyclone）消化后，平均分为三组：嵌合体组加入1ul的CA125- Plk1嵌合体；抗体组加入1ul的CA125抗体；对照组加入1ul的生理盐水，室温孵育20分钟后，PBS清洗三次，之后送流式检测。
1.4 MTT增殖实验
细胞用0.25%的胰酶（Hyclone）消化后，平均分为三组：嵌合体组培养基中加入CA125- Plk1嵌合体，1小时后用PBS清洗三次，加入新鲜培养基；适配体组培养基中加入CA125适配体，1小时后用PBS清洗三次，加入新鲜培养基；对照组进行相同的处理。48小时后，加入20ul的MTT溶液，继续培养4h。之后加入150ul的DMSO，在酶联免疫检测仪检测各组的吸光度。
1.5 Tunel染色
实验分为对照组和嵌合体组，细胞经固定和脱水后，滴加TUNEL反应混合物，37℃孵育60分钟，PBS漂洗3次后，加入DAPI，室温反应5分钟后，PBS清洗三次，之后显微镜下观察荧光的情况。
1.6统计学方法  
应用SPSS软件进行统计学分析，采用t检验进行分析统计，P＜0.05认为结果具有明显的统计学差异。
2 结果
2.1 CA125- Plk1嵌合体能够特异的结合卵巢癌细胞
流式的结果显示嵌合体组约有83.6%的卵巢癌细胞能够结合CA125- Plk1嵌合体，其比例与CA125抗体组类似（P＞0.05），显著的高于对照组（P＜0.05）；而CA125- Plk1嵌合体与CA125抗体均不能结合正常的卵巢细胞，比例与对照组均没有显著的统计学差异（P＞.05）。这说明CA125- Plk1嵌合体能够特异的结合卵巢癌细胞（图1）。
 
图1. CA125- Plk1嵌合体特异的结合卵巢癌细胞。
 
2.2 CA125- Plk1嵌合体抑制卵巢癌细胞的增殖
MTT的结果显示，嵌合体组卵巢癌细胞的平均增殖率为0.32，相对于对照组和适配体分别下降了62.79%和54.93%，结果具有显著的统计学差异（P＜0.05）（表1）。

组别	对照组	适配体组	嵌合体组
增殖率	0.86±0.13	0.71±0.11	0.32±0.04*

表1. CA125- Plk1嵌合体抑制卵巢癌细胞的增殖（*与对照组相比，P＜0.05）
 
2.3 CA125- Plk1嵌合体促进卵巢癌细胞的凋亡
Tunel染色的结果显示嵌合体组卵巢癌细胞中可以见到SiRNA荧光表达，这说明在48小时后，CA125- Plk1嵌合体仍然可以稳定的存在癌细胞中。相对于对照组，嵌合体组卵巢癌细胞凋亡的平均比例上升了2.39倍，差异显著，具有显著的统计学差异（P＜0.05）（图2和表2）。
 
图2. CA125- Plk1嵌合体促进卵巢癌细胞的凋亡（*与对照组相比，P＜0.05）
 

组别	对照组	嵌合体组
凋亡率	0.23±0.014	0.78±0.083*

表2. CA125- Plk1嵌合体促进卵巢癌细胞的凋亡（*与对照组相比，P＜0.05）
 
3 讨论
卵巢癌由于早期症状不明显，发现时多已处于晚期，死亡率十分高。早期诊断对于卵巢癌的治疗和预后具有十分重要的意义。目前常见的方法主要是检测血清中卵巢癌的特异性分子，然而特异性分子从肿瘤细胞脱落达到血清可检测的浓度，需要很长的时间以及一定数量的肿瘤细胞^{[8, 9]}。CA125是卵巢癌较为常见和特异的表面标志，有文献报道其敏感度达到了94.7%^{[10, 11]}。我们设计一种CA125-Plk1嵌合体，其特异性和敏感性与特异性抗体类似，可以很好的结合到癌细胞表面。适配体的合成十分廉价和方便，显著的低于抗体。此外核酸适配体对机体的影响十分小，目前已经有相关产品正在进行临床实验^{[12, 13]}。因此相对与抗体，CA125-Plk1嵌合体具有更好的临床应用前景。
手术切除是目前治疗卵巢癌最主要和有效的手段，最新的研究发现在卵巢癌明确诊断后，中晚期患者先接受有限疗程的化疗，然后再进行手术，效果要优于术后化疗。然而化疗的副作用十分大，使得很多晚期肿瘤的患者很难继续承受手术的打击^[14-16]。我们研究发现CA125-Plk1嵌合体能够靶向卵巢癌细胞，显著抑制卵巢癌细胞的增殖，促进其凋亡，具有一定的治疗效果。核酸适配体的副作用十分的小，远远弱于化疗。同时，经过修饰后，嵌合体的特异性和在体稳定性均十分高，能够达到长期治疗的目的。因此，将CA125-Plk1嵌合体应用于术前治疗可能是一个十分有效的手段。
综上，我们构建了一种CA125-Plk1嵌合体，其能特异性的结合卵巢癌细胞，通过抑制增殖和促凋亡，达到一个潜在的诊断和术前治疗作用。
 
参考文献
[1] Li Y L, Feng Y, Ying H, et al. Identification of suitable reference genes for gene expression studies of human serous ovarian cancer by real-time polymerase chain reaction[J]. Archives of Virology, 2016, 394(3):110-116.
[2] Nguyen L, Cardenasgoicoechea S J, Gordon P, et al. Biomarkers for early detection of ovarian cancer.[J]. Women S Health, 2017, 9(2):186-7.
[3] Zhang L, Lei J, Liu L, et al. Self-assembled DNA hydrogel as switchable material for aptamer-based fluorescent detection of protein.[J]. Analytical Chemistry, 2016, 85(22):11077-82.
[4] Wan W L, Liao Z X, Chuang E Y, et al. An aptamer-conjugated liposomal system containing a bubble-generating agent for tumor-specific chemotherapy overcoming multidrug resistance[J]. Nanomedicine Nanotechnology Biology & Medicine, 2016, 12(2):480.
[5] Mcnamara J O, Andrechek E R, Wang Y, et al. Cell type|[ndash]|specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras[J]. Nature Biotechnology, 2006, 24(8):1005-15.
[6] Dassie J P, Liu X Y, Thomas G S, et al. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors[J]. Nature Biotechnology, 2009, 27(9):839-849.
[7] Lamberti I, Scarano S, Esposito C L, et al. In vitro, selection of RNA aptamers against CA125 tumor marker in ovarian cancer and its study by optical biosensing[J]. Methods, 2015, 97:58-68.
[8] Veigel D, Wagner R, Stübiger G, et al. Fatty acid synthase is a metabolic marker of cell proliferation rather than malignancy in ovarian cancer and its precursor cells[J]. International Journal of Cancer, 2015, 136(9):2078–2090.
[9] Ahmad B, Nawaz S, Ali S, et al. Level and evaluation of tumor marker CA-125 in ovarian cancer patients in Khyber Pakhtunkhwa, Pakistan.[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp, 2015, 16(1):185-189.
[10] Aya Sasaki, Kaoru Akita, Ito F, et al. Difference in mesothelin-binding ability of serum CA125 between patients with endometriosis and epithelial ovarian cancer[J]. International Journal of Cancer, 2015, 136(8):1985–1990.
[11] 房林妹. CA125测定对卵巢癌患者的临床观察[J]. 江苏大学学报医学版, 2001, 11(1):51-52.
[12] Proske D, Blank M, Buhmann R, et al. Aptamers--basic research, drug development, and clinical applications.[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 69(4):367-374.
[13] Sundaram P, Kurniawan H, Byrne M E, et al. Therapeutic RNA aptamers in clinical trials[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences, 2013, 48(1-2):259.
[14] Doo D W, Guy M S, Behbakht K, et al. Association Between Preoperative Chemotherapy and Postoperative Complications in Patients Undergoing Surgery for Ovarian Cancer.[J]. Annals of Surgical Oncology, 2016, 23(3):1-7.
[15] Ranchère J Y, Lombard R, Lupo C. Preoperative chemotherapy of ovarian cancer in anesthesia and resuscitation.[J]. Cahiers Danesthésiologie, 1985, 33(1):5-9.
[16] D. Doo, Guy M, Behbakht K, et al. Effect of preoperative chemotherapy on postoperative morbidity and mortality in patients undergoing surgery for ovarian cancer[J]. Gynecologic Oncology, 2015, 137(3):598-599.