【摘要】目的 探讨Kruppel 样转录因子9 (Kruppel-like transcription factors 9，KLF9) 在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义。方法 搜集63例具有完整临床病理资料及5年以上随访资料的石蜡包埋上皮性卵巢癌组织及正常卵巢上皮组织。采用荧光定量PCR技术检测KLF9 mRNA在上皮性卵巢癌及正常卵巢组织中的表达水平，应用免疫组化法分析KLF9在上皮性卵巢癌组织和正常卵巢组织的表达情况，分析KLF9表达水平与临床病理参数和患者预后的关系。结果 63例癌组织中KLF9 mRNA的表达值为（0.597 ± 0.332），显著低于正常卵巢组织中KLF9 mRNA的表达（1.354 ± 0.471，Z=-4.039，P<0.001）。上皮性卵巢癌组织中，KLF9高表达15例（23.8%），低表达48例（76.2%）；在正常卵巢组织中，KLF9高表达18例（60%），低表达12例（40%），差异有统计学意义(χ²=11.62, P=0.001)。癌组织中KLF9 低表达与上皮性卵巢癌患者的临床分期、淋巴结转、腹腔积液明显相关（P<0.05）。KLF9 mRNA高表达组中位生存时间46.8个月（95% CI：26-83个月），显著高于低表达组（32.6个月，95% CI：12-74个月，P=0.002）。肿瘤组织中KLF9阳性细胞高表达组的中位生存时间为50.2个月（95% CI：32-84个月），明显高于KLF9低表达组（31.1个月，95% CI：12-79个月，P=0.001）。Cox多重回归分析表明KLF9 mRNA和KLF9阳性细胞低表达是影响上皮性卵巢癌预后不良的独立指标（HR=2.64，95% CI：1.14-3.56，P=0.017；HR=3.01，95% CI：2.19-4.51，P=0.01）。结论 KLF9在上皮性卵巢癌组织中表达下调，与上皮性卵巢癌患者预后不良相关。
【关键词】KLF9；上皮性卵巢癌；预后；临床意义
Investigate expression and clinical significant of KLF9 in patients with epithelial ovarian carcinoma and the clinical significance
【Abstract】 Objective To investigate the expression of KLF9 (Kruppel-like transcription factors 9) in epithelial ovarian carcinoma and the clinical significance. Methods 63 cases of formalin-fixed paraffin embedded samples from epithelial ovarian carcinoma patients with 5 years follow-up and detailed clinicopathological information were selected. The expression of KLF9 mRNA was quantified by realtime-PCR. Immunohistochemistry (IHC) was used to determine the KLF9 expression in paraffin-embedded tissues. The relationship between KLF9 and the clinicopathological factors and the prognosis were analyzed. Results The expression of KLF9 mRNA in epithelial ovarian carcinoma tissues (0.597 ± 0.332) was significantly decreased as compared with that in the normal ovarian tissues (1.354 ± 0.471，Z=-4.039，P<0.001). Compared with normal tissues, tumor tissues showed low expression of KLF9 (76.2% vs 40.3%, χ²=11.62, P=0.001). The low expression of KLF9 was associated with TNM stage, lymph node metastases and ascetic fluid (P<0.05). The overall survival of KLF9 mRNA high expression group was 46.8 months (95% CI: 26-83 months), significant longer than KLF9 mRNA low expression group (32.6 months, 95% CI: 12-74 months; P=0.002). The overall survival of KLF9⁺ cells high expression group was 50.2 months (95% CI: 32-84 months), significant longer than KLF9⁺ cells low expression group (31.1 months, 95% CI: 12-79 months; P=0.001). Cox regression analysis showed that KLF9 mRNA and KLF9⁺ cells low expression were one of independent prognostic impact (HR=2.64，95% CI: 1.14-3.56, P=0.017; HR=3.01, 95% CI: 2.19-4.51, P=0.01) for epithelial ovarian carcinoma. Conclusions The expression of KLF9 was down-regulated and associated with poor prognosis in epithelial ovarian carcinoma, KLF9 may serve as a tumor suppressor in the development of epithelial ovarian carcinoma.
【Keywords】KLF9; Epithelial ovarian carcinoma; Prognosis; Clinical significance
 
Kruppel样转录因子9 (Kruppel-like transcription factors 9，KLF9) 是KLF转录因子家族成员之一^[1]。KLF是具有锌指结构域的DNA结合蛋白，广泛参与细胞的增殖、分化、发育等重要生理过程^[1]。最近研究证实，KLF9在多种肿瘤组织中分布和表达，KLF9可以通过多种信号途径影响肿瘤细胞的增殖和凋亡，进而影响肿瘤的发生发展^[2]，但是其在肿瘤中的确切作用及其机制还有待深入研究。目前KLF9在上皮性卵巢癌中的表达和生物学作用国内外还未见相关研究，我们通过检测上皮性卵巢癌患者肿瘤组织中KLF9的表达水平，分析其与上皮性卵巢癌患者临床病理特征及预后的关系，探讨KLF9在上皮性卵巢癌发生发展中的作用。
 
资料与方法
1. 一般资料 收集我院妇科2009年5月至2011年5月间存档的上皮性卵巢癌患者卵巢癌组织蜡块63例，所有病例具有完整临床病理资料及5年以上随访资料，且经组织病理学证实，其中浆液性癌39例，黏液性癌20例，子宫内膜癌3例，透明细胞癌1例。按照国际妇产科联盟（FIGO）2000年病理分期标准，I期14例，II期11例，III期33例，IV期5例。病理分化程度：低分化23例，高分化40例。全部病例术前均未接受放化疗，免疫治疗及烟酒、毒物等危险因素。患者年龄23～68岁，中位年龄43.7岁。30例正常对照组织蜡块为因子宫肌瘤行子宫加附件切除患者的正常卵巢上皮组织标本，患者年龄25-66岁，中位年龄为42.8岁。所有患者均签署知情同意书，并报医院伦理委员会通过。
2. 总RNA提取：将石蜡包埋的组织切成厚20μm的薄片，取5张切片常规脱蜡，55℃蛋白酶K消化6h后，按照石蜡组织总RNA提取试剂盒（ABI公司）说明书进行抽提。DEPC水溶解后采用分光光度计测定RNA的浓度和纯度，A₂₆₀/A₂₈₀大于1.8方可用于后续逆转录。
3. 逆转录反应：将10μl总RNA，2μl Oligo(dT)₁₈，2μl dNTPmix充分混匀后，置65℃作用5min后迅速冰上冷却，再加入4μl 5×RT缓冲液，1μl Ribonuclease Inhibitor，最后加入1μl MMLV逆转录酶（200U/μl）至终体积为20μl，42℃作用1h，70℃作用10min后冰上冷却，获得的cDNA第一链立即行PCR或-80℃冰箱保存待用。
4. 荧光定量PCR：应用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒（Applied Biosystems）进行检测。KLF9上游引物：5’- ACAGTGGCTGTGGGAAAGTC-3’，下游引物：5’ TCACAAAGCGTTGGCCAGCG-3’。内参β-actin上游引物：5’- GACTACCTCATGAAGATCCTCACC-3’，下游引物5’- TCTCCTTAATGTCACGCACGATT-3’。PCR扩增条件：95℃10 s，95℃5s 60℃41s，40个循环。所有反应设置3个复孔。采用相对定量法，以2^-ΔCt表示癌组织及正常组织中目的基因的相对表达量，其中ΔCt=(Ct_KLF9-Ct_β-actin)。
5. 免疫组化法检测组织标本中KLF9的表达：将石蜡包埋的组织块切成厚4μm的薄片，采用免疫组化SP法，按照SP检测试剂盒说明书所示步骤进行，切片经柠檬酸缓冲液(PH=6.0)高压抗原热修复预处理，PBS代替一抗作为阴性对照。兔抗人KLF9多克隆抗体（1:100，ab26074）购自美国Abcam公司。结果判定：KLF9阳性细胞的判定以细胞核或细胞浆呈棕黄色和（或）棕褐色为阳性表达。用奥林巴斯光学显微镜及Image-Pro Plus V6.0图像分析软件进行统计分析。首先在低倍镜下寻找细胞分布均匀的区域，然后在高倍镜 (40×10)下进行阳性细胞计数，随机计数5个高倍视野的阳性细胞数目，取平均值以阳性细胞数/HPF表示。染色结果分析：细胞数<1为(-)，1～5为(+)，6～19为(++)，≥20为(+++)，以(-)(+)为低表达，(++)(+++)为高表达。
6. 统计学方法：应用SPSS 16.0统计软件分析，数据均以均数±标准差(±S)表示。KLF9的分界值通过X-tile 3.6.1分析软件获取。采用Wilcoxon非参数符号秩和检验分析上皮性卵巢癌组织和正常卵巢上皮组织中KLF9的表达差异，用Mann-Whitney U检验(两组)和Kruskal-Wallis H检验(多组)分析KLF9表达水平与上皮性卵巢癌患者临床各病理参数之间的关系，采用Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析KLF9及临床病理特征与上皮性卵巢癌患者预后的关系。
结果
1. KLF9在上皮性卵巢癌组织中的表达：荧光定量PCR结果显示，63例卵巢癌组织中KLF9 mRNA的表达值为0.597 ± 0.332，而正常上皮组织中KLF9 mRNA的表达值为1.354 ± 0.471，显著高于癌组织 (Z=-4.039，P<0.001)。免疫组化结果显示，KLF9蛋白阳性染色主要定位于细胞核与细胞质，呈棕黄色或棕褐色颗粒或团块，染色均一。在卵巢癌组织和正常组织均可检测到KLF9蛋白的表达。63例卵巢癌组织标本中，KLF9高表达15例（23.8%），低表达48例（76.2%）；在正常上皮组织中，KLF9高表达18例（60%），低表达12例（40%），差异有统计学意义(χ²=11.62, P=0.001)。直线相关分析表明，卵巢癌患者肿瘤组织中KLF9 mRNA水平与组织中KLF9阳性细胞呈正相关( r=0.354 P=0.028)。
2. KLF9表达水平与临床病理特征之间的关系：卵巢癌组织中KLF9 mRNA低表达与卵巢癌患者的临床分期、腹腔积液明显相关（P<0.05），与其他病理特征无明显相关（P>0.05）。肿瘤组织中KLF9阳性细胞表达水平与临床分期、淋巴结转移、腹腔积液明显相关（P<0.05），与其他临床病理特征无明显相关（P>0.05）。结果见表1。 
表1. KLF9表达水平与甲状腺癌临床病理特征之间的关系

临床病理特征	KLF9 mRNA				KLF9 阳性细胞
	例数	(`x±SD)	t值	P 值	高表达 (n)	低表达 (n)	χ2值	P 值
年龄
≤45岁	33	0.584±0.31	0.376	0.712	7	26	0.258	0.612
﹥45岁	30	0.601±0.29			8	22
病理类型
浆液性	39	0.609±0.28	0.45	0.654	8	31	0.659	0.719
黏液性	20	0.579±0.31			6	14
其他	4	0.604±0.34			1	3
淋巴结转移
无	53	0.629±0.34	0.97	0.341	15	38	3.656	0.05
有	10	0.578±0.28			0	10
临床分期
Ⅰ-Ⅱ期	25	0.654±0.34	5.647	0.014	11	14	9.166	0.002
Ⅲ-Ⅳ期	38	0.550±0.31			4	34
病理分化
低分化	23	0.618±0.28	0.74	0.574	8	15	2.404	0.121
高分化	40	0.591±0.31			7	33
腹腔积液量 （mL）
≤500	47	0.644±0.34	3.94	0.034	14	33	3.587	0.048
﹥500	16	0.534±0.26			1	15

 
3. KLF9表达水平与上皮性卵巢癌预后的关系：所有病例随访至2016年5月，中位随访时间为66个月。以KLF9 mRNA表达水平中位值2^-ΔCt=0.597作为截断值，Kaplan-Meier生存分析表明，KLF9 mRNA高表达组，总生存率显著延长；高表达组生存率48.6%，中位生存时间46.8个月（95% CI：26-83个月），低表达组生存率24.5%，中位生存时间32.6个月（95% CI：12-74个月），两组差异有统计学意义（P=0.002）。利用X-tile软件将KLF9在上皮性卵巢癌组织中的表达分为高表达组和低表达组，KLF9高表达组患者的生存率为46.2%，中位生存时间为50.2个月（95% CI：32-84个月），KLF9低表达组生存率为20.6%，中位生存时间31.1个月（95% CI：12-79个月），两组间具有统计学差异（P=0.001）。单因素分析表明，KLF9 mRNA和KLF9阳性细胞低表达均是上皮性卵巢癌预后不良指标之一（HR=3.287，95% CI：2.14-5.78，P=0.006；HR=4.792，95% CI：2.72-7.16，P=0.003；）。Cox多重回归分析表明KLF9 mRNA和KLF9阳性细胞低表达均是影响上皮性卵巢癌预后不良的独立指标（HR=2.64，95% CI：1.14-3.56，P=0.017；HR=3.01，95% CI：2.19-4.51，P=0.01）。
 
讨 论
上皮性卵巢癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤之一，发病高峰年龄为50岁左右。由于卵巢位于盆腔底部，肿瘤发病隐匿、早期病变难以被及早发现，因此，超过70％的上皮性卵巢癌患者诊断时已属晚期^[3]。更为严重的是，相当一部分患者治疗后仍会出现复发，导致其5年生存率不超过30％^[4]。上皮性卵巢癌的发生发展经历了一个多基因改变、多步骤发展的复杂过程，涉及众多癌基因的 激活和抑癌基因的失活^[5]。因此阐明特定基因在上皮性卵巢癌中的表达调控规律，对研究上皮性卵巢癌发病机制及其临床干预具有重要意义。
KLF即Kruppel样转录因子，因其DNA结合区域与果蝇属胚胎发育调控因子Kruppel高度相似而得名^[6]。目前已发现至少20种KLFs，KLF家族在机体重要组织器官的发育以及细胞的增殖、分化、凋亡、周期调控等方面发挥着重要作用。近年来研究表明KLF也参与了机体肿瘤的发生发展^[7]。人类的KLF9基因定位于位于染色体9q13，编码144个氨基酸残基组成的蛋白质。KLF9主要通过其羧基末端的3个经典且高度保守的Cys2/His2锌指结构结合DNA，发挥基因调控作用^[1]。研究发现，KLF9基因敲除后不影响小鼠的正常生长，其生长表型与野生型无异，但是雌性KLF9基因缺失小鼠的生殖系统出现缺陷，子宫发育和生殖能力均受影响，因此KLF9在子宫分化发育中发挥重要作用^[8]。近年来发现KLF9在多种人类肿瘤中也存在表达，并逐渐被认为是一个潜在的抑癌基因。Ying等通过全基因组分析发现KLF9是一个转录抑制子，可以调控多条与肿瘤发生、干细胞调节有关的信号通路，KLF9通过抑制ITGA6通路抑制神经母细胞瘤的生长^[9]。Sun等研究表明KLF9在人肝癌组织中表达下调，并且与p53基因表达明显相关^[10]。另外，KLF9能够通过抑制AKT信号通路抑制前列腺癌的生长^[11]。这些研究提示KLF9是一种具有抑制肿瘤生长和转移的新型抑癌基因。
在本研究中，我们应用realtime-PCR技术检测了上皮性卵巢癌石蜡包埋组织中KLF9的表达水平。研究结果显示KLF9在上皮性卵巢癌组织的表达量明显低于其在正常卵巢上皮组织的表达量。我们进一步应用免疫组织化学方法检测KLF9在肿瘤原位的表达情况，结果显示KLF9蛋白阳性染色主要定位于细胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒或团块，染色均一。在癌组织和相应正常组织均可检测到KLF9蛋白的表达，但是KLF9在癌组织的表达水平显著低于正常组织。这些结果与前人在肝癌^[10]、肠癌^[11]、胰腺癌^[12]、乳腺癌^[13]中的研究结果一致。张建新等报道KLF9在胰腺癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常胰腺组织^[12]。田野等发现乳腺癌组织和浸润性细胞系中KLF9表达均下调^[13]。这些结果表明KLF9在肿瘤的发生发展中起到抑癌基因的作用。
在本研究中，肿瘤组织KLF9的异常表达与上皮性卵巢癌患者临床分期、淋巴结转移、腹腔积液密切相关。KLF9表达水平越低，临床分期越晚，越容易出现淋巴结转移，腹腔积液量越多。卵巢癌患者有腹腔积液是预后不良的高危因素，腹腔积液的产生也是晚期患者的特征^[14]。表明KLF9具有抑制上皮性卵巢癌的生长和转移的作用。Brown 等研究发现KLF9通过抑制干扰素相关信号通路抑制结肠癌细胞的生长^[15]。Huang 等在神经胶质瘤中敲除KLF9后促进细胞增殖和小鼠体内肿瘤的生长，其机制是下调了miR-21分子^[16]。另外，在本研究中，生存分析也证实了这一推论，上皮性卵巢癌组织中KLF9⁺细胞高表达者，总生存率显著延长，生存时间较低表达者延长达20个月。Cox多重回归分析表明KLF9低表达是上皮性卵巢癌预后不良的独立指标之一，表明KLF9低表达可以作为上皮性卵巢癌预后不良的的独立指标。关于KLF9在上皮性卵巢癌发生发展中的机制及还有待进一步研究。
本研究结果表明，KLF9在上皮性卵巢癌组织中表达下调，与上皮性卵巢癌的临床分期、淋巴结转移密切相关，KLF9低表达可以作为上皮性卵巢癌预后不良的的独立指标。
 
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