客服中心
联系手机：13968834878（吴老师）
发表ＱＱ：
4271308
编辑ＱＱ：25786532
编辑邮箱：zjdxjt5@163.com
联系地址：浙江杭州萧山区金城路185号
本站介绍
“薪火传承 思源致远”，杭州茴香医药科技有限公司栉风沐雨，历经19个春秋，成为一所“综合性、研究型”的一流综合型写作机构，并向一流写作服务机构稳步迈进。“论文撰稿一流精华，论文发表独家优势”，本公司以“宁失万贯，不失诚信，仰不愧于天，俯不怍于地”为宗旨,以“按时是我们诚信基础，录用是我们工作目标”为己任，致力于探索学术领域，攀登学术高峰，满足客户需求，凭借拥有国内多所著名高校人才资源优势，撰稿修改文章已有31700多篇在SCI、权威期刊、核心期刊上发表...更多
IL-13促进颈动脉损伤后快速内皮化修复及其机制研究
摘要 目的：探讨白介素-13（IL-13）对小鼠颈动脉内皮细胞层导丝损伤后内皮化修复的作用及其机制研究。方法：取相同周龄和性别的小鼠，对其颈动脉进行导丝损伤。之后随机分为两组：对照组和IL-13组，IL-13组每只小鼠每天腹腔注射300 ng的IL-13。连续注射三天后，取小鼠的心脏血，分离出单核细胞。用PE-CD34抗体和APC-VEGFR-2抗体标记内皮祖细胞，进行流式检测。ELISA试剂盒检测血浆中血管内皮生长因子（VEGF）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）的含量。分离小鼠损伤的颈动脉，冰冻切片进行HE染色，观察损伤后内皮修复的情况。结果：ELISA的结果显示IL-13可以促进血浆中VEGF含量的显著升高（P＜0.05),而对SDF-1的浓度没有明显的作用。流式细胞分析的结果表明IL-13处理组CD34和VEGFR-2均表达阳性的内皮祖细胞的比例显著的升高，约为对照组的4.8倍。同时，HE染色的结果也表明IL-13的处理可以显著的促进颈动脉内皮损伤后的快速修复，而对照组内皮化程度不明显。结论：IL-13通过诱导内皮祖细胞从骨髓的动员来促进颈动脉损伤后的快速内皮化，这一过程可能与血浆中VEGF的浓度升高相关。
关键词：白介素-13，内皮化，内皮祖细胞，血管内皮生长因子
The effect of IL-13 on rapid endothelialization of wire damaged blood vessels
Abstract Objective：To study the effect of IL-13 on rapid endothelialization of wire damaged blood vessels and its mechanism. Method：Wire injury in the carotid artery was performed after anesthesia in 8-week-old C57BL/6 mice. Then the mice were divided into two groups：control group and IL-13 group. The day after injury, each mouse of the experimental group was intraperitoneally injected with 300ng each day for 3 days. On day four, the peripheral blood was isolated from each mouse and the mononuclear cell layer was extracted. The number of PE-CD34/APC-VEGFR-2-positive cells was determined using flow cytometry. Serum VEGF and SDF-1 levels in injured mice were determined using a VEGF-ELISA kit. Besides, the HE staining was used to the endothelialization of blood vessels. Results：ELISA results showed IL-13 could significantly improve the concentrations of VEGF（P＜0.05), but it did not affect the SDF-1 concentrations in the blood. Flow cytometry analysis demonstrated that the mobilization of C57BL/6 mouse endothelial progenitor cells increased after IL-13 treatment. The numbers of CD34/VEGFR-2 cells in the IL-13 group were approximately 4.8-fold greater than those in the control group. HE staining showed a better endothelialization in the IL-13 group. Conclusion：IL-13 could promote rapid endothelialization of wire damaged blood vessels through endothelial progenitor cells mobilization, and this process was associated with VEGF increasing in the blood.
Key words：IL-13, Endothelialization, Endothelial progenitor cell, VEGF
近几年，人民生活水平的提高使得我国脑血管疾病的发病率逐年上升。据统计，目前我国现存脑血管病患者达到700余万人，而这一数字在不断上升，已经成为我国致残和死亡的主要病因[1]。动脉狭窄是造成缺血性脑血管病的一个重要病因和危险因素，目前主要通过球囊血管成形术或者外科手术进行治疗，这些治疗手段均严重的损伤了动脉的内皮细胞层。内皮细胞在抑制血栓形成和血管内膜增生中发挥着十分重要的作用[2]，因此如何促进术后血管内皮细胞层的快速修复对于脑血管疾病的治疗具有十分重要的意义。
内皮祖细胞是内皮细胞的前体干细胞，主要存在于骨髓和外周血中。在某些诱导因子如血管内皮生长因子（VEGF或者SDF-1）的作用下，可以从骨髓中动员出来，归巢到缺血或者损伤的部位，促进血管生成或者直接分化形成内皮细胞[3]。然而正常人外周血内皮祖细胞的数量十分的少，这一比例在脑血管病患者体内更小，使其很难满足快速内皮化的需求[4]。选择合适的诱导分子诱导更多的内皮祖细胞从骨髓中动员可以有效的促进损伤血管的快速内皮化。
白介素-13（IL-13）是机体内重要的免疫调节因子，研究发现其在激活的T细胞上表达[5]。IL-13主要发挥抑制过度炎症反应和促进组织再生的作用。此外，IL-13与血管生成紧密相关，研究表明IL-13可以促进内皮细胞表达血管细胞黏附分子，而血管细胞黏附分子与血管新生紧密相关[6]。然而目前还没有文献报道IL-13与内皮祖细胞的相关性。因此，本文拟运用颈动脉损伤模型，研究IL-13对内皮祖细胞动员影响及其对血管内皮损伤修复的作用。
1 材料和方法
1.1 试剂
IL-13购买于美国Peprotech 公司，APC-VEGFR-2和PE-CD34购买于Abcom公司，VEGF和SDF-1的ELISA试剂盒购买于RD公司，红细胞裂解液购于天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 仪器与设备
酶标仪（美国BioTek公司），流式细胞仪（BD公司），光学显微镜（日本Olympus公司）
1.3 小鼠导丝损伤模型
实验选取8周龄左右的C57BL/6J小鼠，均为雄性。小鼠用戊巴比妥麻醉后，分离出左颈总动脉，结扎颈外动脉，血管夹暂时阻断颈部的血液供应。显微剪轻微的剪开颈外动脉，插入金属导丝，来回进退五次，损伤颈总动脉的内皮细胞。结扎好颈外动脉的近心侧后，缝合皮肤。之后将小鼠饲养于合适的温度和湿度条件下，给予充足的水分和食物。IL-13处理组腹腔注射300ng 的IL-13，连续注射三天。
1.4 内皮祖细胞的分离和标记
颈动脉损伤三天后，取小鼠的心脏血，3000转离心五分钟。上清取出置入-80冰箱保存，以后进行ELISA检测。下层的细胞用红细胞裂解液重悬，裂解十分钟，连续裂解三次后，用APC-VEGFR-2和PE-CD34进行标记。染色30分钟后，PBS清洗三次，进行流式检测。
1.5 ELISA检测
我们使用ELISA试剂盒检测小鼠血浆中VEGF和SDF-1的含量。具体过程如下：取待检样品0.1ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时；加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟；450nm光谱下检测各孔的吸光值。
2 实验结果
2.1 IL-13促进血清中VEGF浓度的升高
ELISA的结果显示铁丝损伤后，IL-13组血浆中VEGF的含量是对照组的2.4倍，具有显著的统计学差异（P＜0.05）。而IL-13组血浆中SDF-1的含量与对照组没有显著的差别（见图1）。
注：与对照组相比，*代表P＜0.05
图1 血浆中VEGF和SDF-1的含量
2.2 IL-13促进内皮祖细胞的动员
我们运用APC-VEGFR-2和PE-CD34标记外周血单核细胞中的内皮祖细胞，结果显示IL-13组内皮祖细胞的比例约为2.4%，而对照组仅为0.48%，仅为处理组的20%（见图2A和图2B）。这说明IL-13可以促进内皮祖细胞的动员,使外周血中内皮祖细胞的数量显著的增加（见图２C）。
注：A，对照组内皮祖细胞的比例；B，IL-13组内皮祖细胞的含量；C，统计图，与对照组相比，*代表P＜0.05
图2 单核细胞中内皮祖细胞的比例
2.3 IL-3促进铁丝损伤动脉的快速内皮化
HE染色的结果显示IL-13组的颈动脉在损伤三天后形成了完整的内皮细胞层，内皮细胞的突起十分的明显。而对照组的血管未见明显的内皮化，仅见少许的内皮细胞突起（见图３）。
3 讨论
内皮细胞构成血管的内壁，在抑制血栓形成和内膜增生中发挥着十分重要的作用[2]。因此促进创伤性治疗引起动脉损伤后的快速内皮化对于治疗各种脑血管疾病具有十分重要。我们选择了一种免疫调节因子IL-13作为之类因子，结果发现在连续治疗三天后，损伤的内皮细胞层可以快速的修复。修复后的内皮细胞可以抑制手术引起的血栓形成以及后期继发的内膜增生，具有很强的治疗意义。
图3 光镜下HE染色的图像（200×）
内皮祖细胞是内皮细胞的前体干细胞，具有分化为内皮细胞和促进血管生成的功能。我们的研究发现IL-13可以促进内皮祖细胞的动员，使外周血中的内皮祖细胞的数量增加了近五倍。增加的内皮祖细胞可以归巢到受损的血管表面，一方面可以分泌各种促血管生成的因子，促进外周内皮细胞的迁移；一方面可以直接分化形成内皮细胞，直接参与损伤的血管的重新内皮化。因此我们相信IL-13是通过诱导内皮祖细胞的动员来促进血管的快速内皮化。
SDF-1与VEGF均是目前公认的内皮祖细胞的动员因子，我们检测了血浆中的各因子的含量。结果发现只有VEGF的浓度显著的升高，而SDF-1的含量却没有显著的变化，这说明IL-13可能是通过促进血浆中VEGF含量的升高，来进一步促进内皮祖细胞的动员。
综上所述，IL-13可以通过促进内皮祖细胞的动员，来促进导丝损伤颈动脉的快速内皮化，而这一过程可能与外周血中VEGF的升高紧密相关，其更深的机制还需要进一步的研究。
4 参考文献
[1]饶明俐,邓方.缺血性脑血管病急性期治疗方法选择[J].中国实用内科杂志,2008,10: 831-832
[2]JJ Castellot,ML Addonizio,R Rosenberg,etal. Cultured endothelial cells produce heparinlike inhibitor of smooth muscle cell growth[J].The Journal of Cell Biology,1981,90(2):372-379
[3] T Asahara, T Takahashi, H Masuda,etal. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow‐derived endothelial progenitor cells[J]. Cell Molecular Biology,1999,18(14):3964-3972
[4] T Takahashi, C Kalka, H Masuda,etal. Ischemia-and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization[J]. Nature medicine,1999,5:434-438
[5]G Grünig, M Warnock, AE Wakil,etal.Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma[J]. Science, 1998, 282 (5397): 2261-2263
[6] BS Bochner, DA Klunk, SA Sterbinsky,etal. IL-13 selectively induces vascular cell adhesion molecule-1 expression in human endothelial cells. [J].The Journal of Immunology,1995,154(2):799-803
关键词：白介素-13，内皮化，内皮祖细胞，血管内皮生长因子
The effect of IL-13 on rapid endothelialization of wire damaged blood vessels
Abstract Objective：To study the effect of IL-13 on rapid endothelialization of wire damaged blood vessels and its mechanism. Method：Wire injury in the carotid artery was performed after anesthesia in 8-week-old C57BL/6 mice. Then the mice were divided into two groups：control group and IL-13 group. The day after injury, each mouse of the experimental group was intraperitoneally injected with 300ng each day for 3 days. On day four, the peripheral blood was isolated from each mouse and the mononuclear cell layer was extracted. The number of PE-CD34/APC-VEGFR-2-positive cells was determined using flow cytometry. Serum VEGF and SDF-1 levels in injured mice were determined using a VEGF-ELISA kit. Besides, the HE staining was used to the endothelialization of blood vessels. Results：ELISA results showed IL-13 could significantly improve the concentrations of VEGF（P＜0.05), but it did not affect the SDF-1 concentrations in the blood. Flow cytometry analysis demonstrated that the mobilization of C57BL/6 mouse endothelial progenitor cells increased after IL-13 treatment. The numbers of CD34/VEGFR-2 cells in the IL-13 group were approximately 4.8-fold greater than those in the control group. HE staining showed a better endothelialization in the IL-13 group. Conclusion：IL-13 could promote rapid endothelialization of wire damaged blood vessels through endothelial progenitor cells mobilization, and this process was associated with VEGF increasing in the blood.
Key words：IL-13, Endothelialization, Endothelial progenitor cell, VEGF
近几年，人民生活水平的提高使得我国脑血管疾病的发病率逐年上升。据统计，目前我国现存脑血管病患者达到700余万人，而这一数字在不断上升，已经成为我国致残和死亡的主要病因[1]。动脉狭窄是造成缺血性脑血管病的一个重要病因和危险因素，目前主要通过球囊血管成形术或者外科手术进行治疗，这些治疗手段均严重的损伤了动脉的内皮细胞层。内皮细胞在抑制血栓形成和血管内膜增生中发挥着十分重要的作用[2]，因此如何促进术后血管内皮细胞层的快速修复对于脑血管疾病的治疗具有十分重要的意义。
内皮祖细胞是内皮细胞的前体干细胞，主要存在于骨髓和外周血中。在某些诱导因子如血管内皮生长因子（VEGF或者SDF-1）的作用下，可以从骨髓中动员出来，归巢到缺血或者损伤的部位，促进血管生成或者直接分化形成内皮细胞[3]。然而正常人外周血内皮祖细胞的数量十分的少，这一比例在脑血管病患者体内更小，使其很难满足快速内皮化的需求[4]。选择合适的诱导分子诱导更多的内皮祖细胞从骨髓中动员可以有效的促进损伤血管的快速内皮化。
白介素-13（IL-13）是机体内重要的免疫调节因子，研究发现其在激活的T细胞上表达[5]。IL-13主要发挥抑制过度炎症反应和促进组织再生的作用。此外，IL-13与血管生成紧密相关，研究表明IL-13可以促进内皮细胞表达血管细胞黏附分子，而血管细胞黏附分子与血管新生紧密相关[6]。然而目前还没有文献报道IL-13与内皮祖细胞的相关性。因此，本文拟运用颈动脉损伤模型，研究IL-13对内皮祖细胞动员影响及其对血管内皮损伤修复的作用。
1 材料和方法
1.1 试剂
IL-13购买于美国Peprotech 公司，APC-VEGFR-2和PE-CD34购买于Abcom公司，VEGF和SDF-1的ELISA试剂盒购买于RD公司，红细胞裂解液购于天根生化科技(北京)有限公司。
1.2 仪器与设备
酶标仪（美国BioTek公司），流式细胞仪（BD公司），光学显微镜（日本Olympus公司）
1.3 小鼠导丝损伤模型
实验选取8周龄左右的C57BL/6J小鼠，均为雄性。小鼠用戊巴比妥麻醉后，分离出左颈总动脉，结扎颈外动脉，血管夹暂时阻断颈部的血液供应。显微剪轻微的剪开颈外动脉，插入金属导丝，来回进退五次，损伤颈总动脉的内皮细胞。结扎好颈外动脉的近心侧后，缝合皮肤。之后将小鼠饲养于合适的温度和湿度条件下，给予充足的水分和食物。IL-13处理组腹腔注射300ng 的IL-13，连续注射三天。
1.4 内皮祖细胞的分离和标记
颈动脉损伤三天后，取小鼠的心脏血，3000转离心五分钟。上清取出置入-80冰箱保存，以后进行ELISA检测。下层的细胞用红细胞裂解液重悬，裂解十分钟，连续裂解三次后，用APC-VEGFR-2和PE-CD34进行标记。染色30分钟后，PBS清洗三次，进行流式检测。
1.5 ELISA检测
我们使用ELISA试剂盒检测小鼠血浆中VEGF和SDF-1的含量。具体过程如下：取待检样品0.1ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时；加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤；各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟；450nm光谱下检测各孔的吸光值。
2 实验结果
2.1 IL-13促进血清中VEGF浓度的升高
ELISA的结果显示铁丝损伤后，IL-13组血浆中VEGF的含量是对照组的2.4倍，具有显著的统计学差异（P＜0.05）。而IL-13组血浆中SDF-1的含量与对照组没有显著的差别（见图1）。
注：与对照组相比，*代表P＜0.05
图1 血浆中VEGF和SDF-1的含量
2.2 IL-13促进内皮祖细胞的动员
我们运用APC-VEGFR-2和PE-CD34标记外周血单核细胞中的内皮祖细胞，结果显示IL-13组内皮祖细胞的比例约为2.4%，而对照组仅为0.48%，仅为处理组的20%（见图2A和图2B）。这说明IL-13可以促进内皮祖细胞的动员,使外周血中内皮祖细胞的数量显著的增加（见图２C）。
注：A，对照组内皮祖细胞的比例；B，IL-13组内皮祖细胞的含量；C，统计图，与对照组相比，*代表P＜0.05
图2 单核细胞中内皮祖细胞的比例
2.3 IL-3促进铁丝损伤动脉的快速内皮化
HE染色的结果显示IL-13组的颈动脉在损伤三天后形成了完整的内皮细胞层，内皮细胞的突起十分的明显。而对照组的血管未见明显的内皮化，仅见少许的内皮细胞突起（见图３）。
3 讨论
内皮细胞构成血管的内壁，在抑制血栓形成和内膜增生中发挥着十分重要的作用[2]。因此促进创伤性治疗引起动脉损伤后的快速内皮化对于治疗各种脑血管疾病具有十分重要。我们选择了一种免疫调节因子IL-13作为之类因子，结果发现在连续治疗三天后，损伤的内皮细胞层可以快速的修复。修复后的内皮细胞可以抑制手术引起的血栓形成以及后期继发的内膜增生，具有很强的治疗意义。
图3 光镜下HE染色的图像（200×）
内皮祖细胞是内皮细胞的前体干细胞，具有分化为内皮细胞和促进血管生成的功能。我们的研究发现IL-13可以促进内皮祖细胞的动员，使外周血中的内皮祖细胞的数量增加了近五倍。增加的内皮祖细胞可以归巢到受损的血管表面，一方面可以分泌各种促血管生成的因子，促进外周内皮细胞的迁移；一方面可以直接分化形成内皮细胞，直接参与损伤的血管的重新内皮化。因此我们相信IL-13是通过诱导内皮祖细胞的动员来促进血管的快速内皮化。
SDF-1与VEGF均是目前公认的内皮祖细胞的动员因子，我们检测了血浆中的各因子的含量。结果发现只有VEGF的浓度显著的升高，而SDF-1的含量却没有显著的变化，这说明IL-13可能是通过促进血浆中VEGF含量的升高，来进一步促进内皮祖细胞的动员。
综上所述，IL-13可以通过促进内皮祖细胞的动员，来促进导丝损伤颈动脉的快速内皮化，而这一过程可能与外周血中VEGF的升高紧密相关，其更深的机制还需要进一步的研究。
4 参考文献
[1]饶明俐,邓方.缺血性脑血管病急性期治疗方法选择[J].中国实用内科杂志,2008,10: 831-832
[2]JJ Castellot,ML Addonizio,R Rosenberg,etal. Cultured endothelial cells produce heparinlike inhibitor of smooth muscle cell growth[J].The Journal of Cell Biology,1981,90(2):372-379
[3] T Asahara, T Takahashi, H Masuda,etal. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow‐derived endothelial progenitor cells[J]. Cell Molecular Biology,1999,18(14):3964-3972
[4] T Takahashi, C Kalka, H Masuda,etal. Ischemia-and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization[J]. Nature medicine,1999,5:434-438
[5]G Grünig, M Warnock, AE Wakil,etal.Requirement for IL-13 independently of IL-4 in experimental asthma[J]. Science, 1998, 282 (5397): 2261-2263
[6] BS Bochner, DA Klunk, SA Sterbinsky,etal. IL-13 selectively induces vascular cell adhesion molecule-1 expression in human endothelial cells. [J].The Journal of Immunology,1995,154(2):799-803