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MicroRNA-143通过促进HOXA10表达抑制子宫内膜异位发生的研究
【摘要】 目的 构建MicroRNA-143慢病毒载体并探讨其在子宫内膜异位发生中的作用及机制。方法 分离培养正位和异位子宫内膜基质细胞，检测HOXA10蛋白和MicroRNA-143的表达；构建MicroRNA-143慢病毒载体并感染子宫内膜基质细胞，流式检测HOXA10蛋白的表达。结果 正位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达的平均荧光强度是异位子宫内膜基质细胞的1.74倍（P＜0.05）；异位子宫内膜基质细胞内MicroRNA-143显著低于正位子宫内膜基质细胞，下降了64.56%（P＜0.05）；MicroRNA-143转染可以显著的促进异位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达，相对于阴性病毒组，平均荧光强度上升了72.03%，差异具有显著的统计学意义（P＜0.05）。MicroRNA-143转染对正位子宫内膜基质细胞没有显著作用（P＞0.05）。结论 子宫内膜异位症患者MicroRNA-143和HOXA10蛋白表达显著下降，通过增强MicroRNA-143表达可以显著上调HOXA10蛋白表达抑制子宫内膜异位症的发生。
【主题词】MicroRNA-143；慢病毒；子宫内膜异位；HOXA10
子宫内膜异位症是一种内膜细胞种植在非正常位置的女性常见妇科疾病，临床主要表现为痛经、月经异常和不孕等症状，严重影响妇女的健康和生活质量。然而目前药物治疗只能暂时缓解患者症状，且副作用十分大。遗传因素被认为是子宫内膜异位症重要的发病机制，从基因调控水平干预可能是预防和治疗子宫内膜异位症的一个有效手段[1, 2]。
同源框基因（HOX）是一种多基因家族的转录调节基因，具有调控胚胎发育和调节子宫内膜容受性的重要功能。HOXA10基因则主要表达于子宫内膜，具有维持子宫内膜正常形态、子宫内膜的增殖和分化和子宫内膜容受性等作用[3, 4]。研究发现正位子宫内膜HOXA10蛋白的表达显著高于异位子宫内膜，HOXA10表达降低会显著增加子宫内膜异位症的风险。MicroRNA与HOXA10表达紧密相关，通过MicroRNA调控HOXA10表达可以达到抑制子宫内膜异位症的目的[5, 6]。MicroRNA-143表达于子宫内膜，与细胞的增殖、分化和肿瘤发生发展紧密相关[7]，然而目前国内外还未见MicroRNA-143与子宫内膜异位症的相关性研究。
1 材料和方法
1.1 材料 MicroRNA-143慢病毒载体构建由广州锐博生物技术有限公司包装构建和鉴定，MicroRNA-143的序列为：TGAGCTACAGTGCTTCATCTCA；胰酶、DMEM/F12基础培养基、胎牛血清和L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；PE-HOXA10抗体购于美国Abcom生物公司；Triton-100购于Sigma公司；慢病毒滴度测定试剂盒购于美国Cell Biolabs公司；细胞内MicroRNA-143的含量由广州锐博生物技术有限公司检测。
1.2 样本收集以及细胞分离 我们收集了10例诊断为子宫内膜异位症并行手术切除治疗患者的样本，同时收集了10例诊断为子宫肌瘤并行手术治疗患者的子宫内膜。子宫内膜基质细胞的分离采用之前报道过的方法[5]：将组织用PBS冲洗3次后，用手术剪剪成小块，之后置于0.25%的胰酶中消化30min，用血清终止消化后过滤网，之后将细胞重悬后置于含有10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基中进行培养。
1.3 细胞培养及分组 我们将两组细胞进一步分为两组：病毒组感染阴性对照慢病毒载体；MicroRNA-143组在感染与对照组相同滴度MicroRNA-143慢病毒载体。为平衡各组的病毒梯度，实验前前我们采用慢病毒滴度测定试剂盒测量了病毒滴度。
1.4 流式检测 我们采用流式检测细胞内HOXA10蛋白表达。细胞用胰酶消化后，500g离心5min。用0.1%的Triton-100穿透5分钟之后，加入PE-HOXA10抗体，室温染色20min后，离心。之后加入适量的PBS，流式检测细胞的平均荧光强度。
1.5统计学方法 应用SPSS 19.0软件分析，采用t检验进行统计，P小于0.05认为结果具有显著统计学差异。
2 实验结果
2.1 正位和异位子宫内膜细胞HOXA10蛋白表达情况 流式的结果显示正位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达的平均荧光强度是异位子宫内膜基质细胞的1.74倍，差异明显（P＜0.05）。（见图1）
图1 HOXA10蛋白表达情况（*与异位子宫内膜组比较，P＜0.05，样本数=10）
Figure 1. Expression of HOXA10 (*P＜0.05, n=10)
2.2 正位和异位子宫内膜基质细胞MicroRNA-143的表达情况 检测结果显示异位子宫内膜基质细胞内MicroRNA-143显著低于正位的子宫内膜基质细胞，下降了64.56%，结果具有统计学意义（P＜0.05）。（见图2）
图2 MicroRNA-143表达情况（与U6的比值，*与异位子宫内膜组比较，P＜0.05，样本数=10）
Figure 2. Expression of MicroRNA-143 (Compared with U6, *P＜0.05, n=10)
2.3 MicroRNA-143促进异位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达 流式的结果MicroRNA-143转染对正位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达没有显著的作用（P＞0.05）。而对于异位子宫内膜基质细胞，MicroRNA-143转染可以显著的促进HOXA10蛋白表达，相对于阴性病毒组，平均荧光强度上升了72.03%，差异具有显著的统计学意义（P＜0.05）。（见图3）
图3 MicroRNA-143促进异位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达（*与对照组比较，P＜0.05，样本数=6）
Figure 3. MicroRNA-143 promotes the expression of HOXA10 protein in ectopic endometrial stromal cells (*P＜0.05, n=6)
3 讨论
子宫内膜异位症是临床一种常见的疾病，虽然不会对患者生命造成伤害，但是会严重影响妇女的健康和生活质量。目前尚无有效的治疗手段，只能运用药物暂时缓解患者症状，严重者甚至需要进行手术治疗[8, 9]。因此寻找子宫内膜异位症的特异性作用靶点是目前研究热点，HOXA10被认为是最有前景治疗靶点之一。HOXA10主要表达于子宫内膜，研究表明HOXA10表达降低或者HOXA10甲基化异常会显著增加子宫内膜异位症及其不孕等并发症发生的风险，HOXA10下调引起FKBP4和Calpain-5蛋白的表达降低可能是子宫内膜异位症发生的机制[10-12]。我们的研究发现子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞HOXA10明显的低于正位子宫内膜基质细胞，这与国内外的研究一致。因此HOXA10可以作为子宫内膜异位症治疗和预防的一个潜在靶点。
MicroRNA与HOXA10表达紧密相关，研究发现MicroRNA135在异位子宫内膜基质细胞中表达降低，而增强细胞内MicroRNA135表达则可以通过上调HOXA10蛋白水平降低子宫内膜异位症的发生[5, 13]。我们分离了正位和异位子宫内膜基质细胞，结果发现异位细胞中MicroRNA-143表达降低，表达量与HOXA10蛋白具有很强的相关性。而进一步病毒转染实验发现MicroRNA-143增加可以上调异位子宫内膜基质细胞的HOXA10蛋白表达，而对正位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达没有显著的作用。MicroRNA-143与细胞的增殖、分化和子宫内膜癌发生发展紧密相关，有研究认为其可以作为肿瘤治疗的一个潜在靶点[7, 14]。我们的研究发现了MicroRNA-143的新的功能，也为子宫内膜异位症预防和治疗提供了新的靶点。
综上，我们的研究子宫内膜异位症患者MicroRNA-143和HOXA10蛋白表达显著下降，通过增强MicroRNA-143表达可以显著上调HOXA10蛋白表达抑制子宫内膜异位症的发生。
4 参考文献
[1] A. Fadhlaoui, J. Bouquet de la Joliniere and A. Feki. Endometriosis and infertility: how and when to treat. Front Surg, 2014, 1: 24
[2] J. Yang and F. Huang. Stem cell and endometriosis: new knowledge may be producing novel therapies. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(11): 3853-3858
[3] L. Zhang, Y. Wan, Y. Jiang, et al. Upregulation HOXA10 homeobox gene in endometrial cancer: role in cell cycle regulation. Med Oncol, 2014, 31(7): 52
[4] L. H. Zhu, L. H. Sun, Y. L. Hu, et al. PCAF impairs endometrial receptivity and embryo implantation by down-regulating beta3-integrin expression via HOXA10 acetylation. J Clin Endocrinol Metab, 2013, 98(11): 4417-4428
[5] R. Petracco, O. Grechukhina, S. Popkhadze, et al. MicroRNA 135 regulates HOXA10 expression in endometriosis. J Clin Endocrinol Metab, 2011, 96(12): 1925-1933
[6] Y. Chen, J. Zhang, H. Wang, et al. miRNA-135a promotes breast cancer cell migration and invasion by targeting HOXA10. BMC Cancer, 2012, 12: 111
[7] B. Zheng, X. Xue, Y. Zhao, et al. The differential expression of microRNA-143, 145 in endometriosis. Iran J Reprod Med, 2014, 12(8): 555-560
[8] G. A. Vilos, J. L. Marks-Adams, A. G. Vilos, et al. Medical treatment of ureteral obstruction associated with ovarian remnants and/or endometriosis: report of three cases and review of the literature. J Minim Invasive Gynecol. 2015, 22(3): 462-468
[9] Y. Kadan, S. Fiascone, C. McCourt, et al. Predictive factors for the presence of malignant transformation of pelvic endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2015, 185: 23-27
[10] A. Zanatta, R. M. Pereira, A. M. Rocha, et al. The relationship among HOXA10, estrogen receptor alpha, progesterone receptor, and progesterone receptor B proteins in rectosigmoid endometriosis: a tissue microarray study. Reprod Sci, 2015, 22(1): 31-37
[11] R. Mormile and G. Vittori. Endometriosis: a history written by aberrant hoxa10 gene expression and epidermal growth factor (EGF) system polymorphism. J Reprod Infertil, 2013, 14(1): 46-47
[12] I. Penna, H. Du, R. Ferriani, et al. Calpain5 expression is decreased in endometriosis and regulated by HOXA10 in human endometrial cells. Mol Hum Reprod, 2008,14(10): 613-618
[13] E. M. Ohlsson Teague, K. H. Van der Hoek, M. B. Van der Hoek, et al. MicroRNA-regulated pathways associated with endometriosis. Mol Endocrinol, 2009, 23(2): 265-275
[14] N Yang, M Long, W Liguang，et al. MicroRNA-143 functions as a tumor suppressor in human esophageal squamous cell carcinoma. Gene, 2013, 517(2): 197-204
【主题词】MicroRNA-143；慢病毒；子宫内膜异位；HOXA10
子宫内膜异位症是一种内膜细胞种植在非正常位置的女性常见妇科疾病，临床主要表现为痛经、月经异常和不孕等症状，严重影响妇女的健康和生活质量。然而目前药物治疗只能暂时缓解患者症状，且副作用十分大。遗传因素被认为是子宫内膜异位症重要的发病机制，从基因调控水平干预可能是预防和治疗子宫内膜异位症的一个有效手段[1, 2]。
同源框基因（HOX）是一种多基因家族的转录调节基因，具有调控胚胎发育和调节子宫内膜容受性的重要功能。HOXA10基因则主要表达于子宫内膜，具有维持子宫内膜正常形态、子宫内膜的增殖和分化和子宫内膜容受性等作用[3, 4]。研究发现正位子宫内膜HOXA10蛋白的表达显著高于异位子宫内膜，HOXA10表达降低会显著增加子宫内膜异位症的风险。MicroRNA与HOXA10表达紧密相关，通过MicroRNA调控HOXA10表达可以达到抑制子宫内膜异位症的目的[5, 6]。MicroRNA-143表达于子宫内膜，与细胞的增殖、分化和肿瘤发生发展紧密相关[7]，然而目前国内外还未见MicroRNA-143与子宫内膜异位症的相关性研究。
1 材料和方法
1.1 材料 MicroRNA-143慢病毒载体构建由广州锐博生物技术有限公司包装构建和鉴定，MicroRNA-143的序列为：TGAGCTACAGTGCTTCATCTCA；胰酶、DMEM/F12基础培养基、胎牛血清和L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；PE-HOXA10抗体购于美国Abcom生物公司；Triton-100购于Sigma公司；慢病毒滴度测定试剂盒购于美国Cell Biolabs公司；细胞内MicroRNA-143的含量由广州锐博生物技术有限公司检测。
1.2 样本收集以及细胞分离 我们收集了10例诊断为子宫内膜异位症并行手术切除治疗患者的样本，同时收集了10例诊断为子宫肌瘤并行手术治疗患者的子宫内膜。子宫内膜基质细胞的分离采用之前报道过的方法[5]：将组织用PBS冲洗3次后，用手术剪剪成小块，之后置于0.25%的胰酶中消化30min，用血清终止消化后过滤网，之后将细胞重悬后置于含有10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基中进行培养。
1.3 细胞培养及分组 我们将两组细胞进一步分为两组：病毒组感染阴性对照慢病毒载体；MicroRNA-143组在感染与对照组相同滴度MicroRNA-143慢病毒载体。为平衡各组的病毒梯度，实验前前我们采用慢病毒滴度测定试剂盒测量了病毒滴度。
1.4 流式检测 我们采用流式检测细胞内HOXA10蛋白表达。细胞用胰酶消化后，500g离心5min。用0.1%的Triton-100穿透5分钟之后，加入PE-HOXA10抗体，室温染色20min后，离心。之后加入适量的PBS，流式检测细胞的平均荧光强度。
1.5统计学方法 应用SPSS 19.0软件分析，采用t检验进行统计，P小于0.05认为结果具有显著统计学差异。
2 实验结果
2.1 正位和异位子宫内膜细胞HOXA10蛋白表达情况 流式的结果显示正位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达的平均荧光强度是异位子宫内膜基质细胞的1.74倍，差异明显（P＜0.05）。（见图1）
图1 HOXA10蛋白表达情况（*与异位子宫内膜组比较，P＜0.05，样本数=10）
Figure 1. Expression of HOXA10 (*P＜0.05, n=10)
2.2 正位和异位子宫内膜基质细胞MicroRNA-143的表达情况 检测结果显示异位子宫内膜基质细胞内MicroRNA-143显著低于正位的子宫内膜基质细胞，下降了64.56%，结果具有统计学意义（P＜0.05）。（见图2）
图2 MicroRNA-143表达情况（与U6的比值，*与异位子宫内膜组比较，P＜0.05，样本数=10）
Figure 2. Expression of MicroRNA-143 (Compared with U6, *P＜0.05, n=10)
2.3 MicroRNA-143促进异位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达 流式的结果MicroRNA-143转染对正位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达没有显著的作用（P＞0.05）。而对于异位子宫内膜基质细胞，MicroRNA-143转染可以显著的促进HOXA10蛋白表达，相对于阴性病毒组，平均荧光强度上升了72.03%，差异具有显著的统计学意义（P＜0.05）。（见图3）
图3 MicroRNA-143促进异位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达（*与对照组比较，P＜0.05，样本数=6）
Figure 3. MicroRNA-143 promotes the expression of HOXA10 protein in ectopic endometrial stromal cells (*P＜0.05, n=6)
3 讨论
子宫内膜异位症是临床一种常见的疾病，虽然不会对患者生命造成伤害，但是会严重影响妇女的健康和生活质量。目前尚无有效的治疗手段，只能运用药物暂时缓解患者症状，严重者甚至需要进行手术治疗[8, 9]。因此寻找子宫内膜异位症的特异性作用靶点是目前研究热点，HOXA10被认为是最有前景治疗靶点之一。HOXA10主要表达于子宫内膜，研究表明HOXA10表达降低或者HOXA10甲基化异常会显著增加子宫内膜异位症及其不孕等并发症发生的风险，HOXA10下调引起FKBP4和Calpain-5蛋白的表达降低可能是子宫内膜异位症发生的机制[10-12]。我们的研究发现子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞HOXA10明显的低于正位子宫内膜基质细胞，这与国内外的研究一致。因此HOXA10可以作为子宫内膜异位症治疗和预防的一个潜在靶点。
MicroRNA与HOXA10表达紧密相关，研究发现MicroRNA135在异位子宫内膜基质细胞中表达降低，而增强细胞内MicroRNA135表达则可以通过上调HOXA10蛋白水平降低子宫内膜异位症的发生[5, 13]。我们分离了正位和异位子宫内膜基质细胞，结果发现异位细胞中MicroRNA-143表达降低，表达量与HOXA10蛋白具有很强的相关性。而进一步病毒转染实验发现MicroRNA-143增加可以上调异位子宫内膜基质细胞的HOXA10蛋白表达，而对正位子宫内膜基质细胞HOXA10蛋白表达没有显著的作用。MicroRNA-143与细胞的增殖、分化和子宫内膜癌发生发展紧密相关，有研究认为其可以作为肿瘤治疗的一个潜在靶点[7, 14]。我们的研究发现了MicroRNA-143的新的功能，也为子宫内膜异位症预防和治疗提供了新的靶点。
综上，我们的研究子宫内膜异位症患者MicroRNA-143和HOXA10蛋白表达显著下降，通过增强MicroRNA-143表达可以显著上调HOXA10蛋白表达抑制子宫内膜异位症的发生。
4 参考文献
[1] A. Fadhlaoui, J. Bouquet de la Joliniere and A. Feki. Endometriosis and infertility: how and when to treat. Front Surg, 2014, 1: 24
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[6] Y. Chen, J. Zhang, H. Wang, et al. miRNA-135a promotes breast cancer cell migration and invasion by targeting HOXA10. BMC Cancer, 2012, 12: 111
[7] B. Zheng, X. Xue, Y. Zhao, et al. The differential expression of microRNA-143, 145 in endometriosis. Iran J Reprod Med, 2014, 12(8): 555-560
[8] G. A. Vilos, J. L. Marks-Adams, A. G. Vilos, et al. Medical treatment of ureteral obstruction associated with ovarian remnants and/or endometriosis: report of three cases and review of the literature. J Minim Invasive Gynecol. 2015, 22(3): 462-468
[9] Y. Kadan, S. Fiascone, C. McCourt, et al. Predictive factors for the presence of malignant transformation of pelvic endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2015, 185: 23-27
[10] A. Zanatta, R. M. Pereira, A. M. Rocha, et al. The relationship among HOXA10, estrogen receptor alpha, progesterone receptor, and progesterone receptor B proteins in rectosigmoid endometriosis: a tissue microarray study. Reprod Sci, 2015, 22(1): 31-37
[11] R. Mormile and G. Vittori. Endometriosis: a history written by aberrant hoxa10 gene expression and epidermal growth factor (EGF) system polymorphism. J Reprod Infertil, 2013, 14(1): 46-47
[12] I. Penna, H. Du, R. Ferriani, et al. Calpain5 expression is decreased in endometriosis and regulated by HOXA10 in human endometrial cells. Mol Hum Reprod, 2008,14(10): 613-618
[13] E. M. Ohlsson Teague, K. H. Van der Hoek, M. B. Van der Hoek, et al. MicroRNA-regulated pathways associated with endometriosis. Mol Endocrinol, 2009, 23(2): 265-275
[14] N Yang, M Long, W Liguang，et al. MicroRNA-143 functions as a tumor suppressor in human esophageal squamous cell carcinoma. Gene, 2013, 517(2): 197-204