摘要  目的：检测SGLT-1、 EGFR和HER-2蛋白在结直肠正常粘膜组织、腺瘤组织、癌组织中的表达，并探讨三者的相关性。方法：选取结直肠癌组织251例，结直肠腺瘤组织80例，正常结直肠粘膜组织167例，采用免疫组织化学法检测SGLT-1、 EGFR和HER-2的表达，比较三组间蛋白表达的差异，分析其与结直肠癌临床病理特征的关系。结果：SGLT-1、EGFR、HER-2蛋白表达阳性率在结直肠癌组织中明显高于腺瘤组织和正常粘膜组织，在腺瘤组织中的表达阳性率高于正常粘膜组织（均P<0.05）。SGLT-1的表达与结直肠癌的分化程度和分期有关(P<0.05) ，EGFR的表达与结直肠癌的分期和淋巴结转移有关(P<0.05)，HER-2的表达与结直肠癌的分化程度、分期和淋巴结转移有关(P<0.05)。结论：SGLT-1、EGFR、HER-2蛋白可能与结直肠癌的早期发生发展有关。联合检测SGLT-1、EGFR和HER-2有助于对结直肠癌的发生及生物学行为判断。
关键词  结直肠癌  SGLT-1  EGFR  HER-2  免疫组织化学
【中图分类号】R735.3         【文献标识码】A
钠葡萄糖转运子1( sodium-dependent glucose transporters，SGLT-1)主要功能是介导葡萄糖和半乳糖的吸收，近年来发现SGLT-1可促进肿瘤细胞对葡萄糖的吸收为其生长提供营养^[1]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor, HER-2）具有同源性，通过不同的信号传导通路，最终导致细胞无序增殖和恶性转化。本研究通过检测SGLT-1、EGFR和HER-2蛋白在结直肠癌、腺瘤和正常粘膜组织中的表达情况，期望为结直肠癌的基础研究、诊断和治疗提供有价值的参考。
1  资料与方法
1.1  一般资料  收集我院2009年10月-2011年10月手术切除及术前未经任何化疗和抗肿瘤治疗的结直肠癌患者的手术标本 251例，男性158例，女性93例，男女比例1.7:1，年龄31-89岁，平均62.0±11.1岁。结直肠腺瘤标本80例。男性51例，女性29例，男女比例1.8:1，年龄5-89岁，平均59.3±14.5岁。将结直肠癌切缘粘膜组织167例，男性105例，女性62例，男女比例1.7：1，年龄33-88岁，平均60.2±10.1岁。所有病理的临床及病理资料完整，切除标本有两名副主任医师做出详细的病理诊断包括病灶的大小、病理组织学类型、病理分级、淋巴结转移情况等。其临床及病理存档资料分别来自病理科和病案室，资料不完整者已去除。
1.2  免疫组织化学  兔抗EGFR抗体、鼠抗HER-2抗体、二步法检测试剂盒、DAB检测试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗SGLT-1抗体购自Abcam 公司。SGLT-1蛋白表达主要在细胞质，有棕褐色颗粒染色为阳性。EGFR蛋白表达主要在细胞质，阳性结果是胞质中有棕褐色颗粒；HER-2蛋白表达主要在细胞膜，可见棕褐色颗粒染色为阳性。每张切片都在随机取5个不重复计数的高倍镜视野，计数所有的细胞，表达强度按阳性细胞所占百分比进行判断，取其平均值，以阳性细胞所占百分比分为三级：阳性细胞<5%为阴性（-），阳性细胞数5%~25%为弱阳性（+），≥25%为强阳性（++）。为了统计学处理，将三组合并为2组：（-）为阴性组，（+）与（++）合并为阳性组（+）。
1.3  统计学方法  采用SPSS14.0统计软件进行统计分析，资料采用X²检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2  结果
2.1  SGLT-1蛋白在结直肠正常粘膜、腺瘤和癌组织中的表达  SGLT-1蛋白在正常粘膜中表达的阳性率为13.8%(23/167)，在腺瘤中表达的阳性率为26.3%(21/80)，在癌中表达的阳性率为60.6%(152/251)，三组中阳性表达率依次升高，经统计学分析，三组中阳性率的表达差别有统计学意义（P<0.05，见图1~3）。
 
Figure 1  The expression of SGLT-1 protein in colorectal normal mucosa （IHC×200）
图1  SGLT-1蛋白在结直肠正常粘膜中的表达（IHC×200）
 
Figure 2  The expression of SGLT-1 protein in colorectal adenoma（IHC×400）
图2  SGLT-1蛋白在结直肠腺瘤中的表达（IHC×400）
 
 
Figure 3  The expression of SGLT-1 protein in colorectal carcinoma（IHC×200）
图3  SGLT-1蛋白在结直肠癌中的表达（IHC×200）
 
2.2  SGLT-1蛋白在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系  SGLT-1蛋白表达与结直肠癌的分化程度和分期有关(P<0.05) ，而与性别、年龄、肿瘤最大径、淋巴结转移无关（P>0.05，见表1）。

Table 1  The relationship of the expression of SGLT-1 protein and clinicopathological features of colorectal cancers 表1  SGLT-1蛋白在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系
Variable	N.	SGLT1		Positive rate (%)	X2	P
		+	-
Gender
Male	158	92	66	58.2	0.97	0.325
Female	93	60	33	64.5
Age（year）
≥50	218	131	87	60.1	0.15	0.698
<50	33	21	12	63.6
Diameter
≥3cm	180	110	70	59.2	0.082	0.775
<3cm	71	42	29	60.6
Differentiation
Well+medium	204	115	89	56.4	7.989	0.005
Worse	47	37	10	78.7
Lymphatic metastasis
N	166	98	68	59.0	0.48	0.491
Y	85	54	31	63.5
Stage
I+II	169	78	91	46.2	44.934	<0.0001
III+IV	82	74	8	90.2

2.3  EGFR蛋白在结直肠正常粘膜、腺瘤和癌组织中的表达  EGFR在正常粘膜中表达的阳性率为21%(35/167)，在腺瘤中表达的阳性率为42.5%(34/80)，在癌中表达的阳性率65.7%(165/251)，经统计学分析，三组中阳性率的表达差别有显著性意义（P<0.05），即EGFR表达的阳性率在腺癌组织中明显高于腺瘤和正常粘膜组织，在腺瘤组织的表达明显高于正常粘膜组织（见图4~6）。
 
Figure 4  The expression of EGFR protein in colorectal normal mucosa（IHC×400）
图4  EGFR蛋白在结直肠正常粘膜的表达（IHC×400）
 
Figure 5  The expression of EGFR protein in colorectal adenoma （IHC×200）
图 5  EGFR 蛋白在结直肠腺瘤中的表达（IHC×200）
 
 
 
 
 
 
Figure 6  The expression EGFR protein in colorectal carcinoma （IHC×400）
图 6  EGFR 蛋白在结直肠癌中的表达（IHC×400）
2.4  EGFR蛋白在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系  EGFR的表
达与结直肠癌的分期和淋巴结转移有关(P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤最大径、分化程度无关（P>0.05），见表2。
 

Table 2  The relationship of the expression of EGFR protein and clinicopathological features of colorectal cancers 表2  EGFR 蛋白在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系
Variable	N	EGFR		Positive rate (%)	X2	P
		+	-
Gender
Male	158	105	53	66.5	0.001	0.973
Female	93	60	30	66.7
Age（year）
≥50	218	145	73	66.5	0.444	0.505
<50	33	20	13	60.6
Diameter
≥3cm	180	123	57	59.2	1.904	0.168
<3cm	71	42	29	65.7
Differentiation
Well+medium	204	139	65	68.1	2.787	0.095
Worse	47	26	21	55.3
Lymphatic metastasis
N	166	101	65	60.8	5.212	0.022
Y	85	64	21	75.3
Stage
I+II	169	88	81	52.1	42.894	<0.0001
III+IV	82	77	5	93.9

2.5 HER-2蛋白在结直肠正常粘膜、腺瘤和癌组织中的表达  HER-2蛋白在正常粘膜中表达的阳性率为19.2% (32/167)，在腺瘤中表达的阳性率为43.8%(35/80)，在癌中表达的阳性率为70.9% (178/251)，经统计学分析，三组中阳性率的表达差别有显著性意义（均P<0.05），即HER-2在腺癌组织中表达的阳性率明显高于其他组织，腺瘤组织高于正常粘膜组织（见图7~9）。
 
Figure 7  The expression HER-2 protein in colorectal normal mucosa （IHC×400）
图 7  HER-2蛋白在结直肠正常粘膜中的表达（IHC×400）
 
Figure 8  The expression of HER-2 protein in colorectal adenoma（IHC×200）
图 8  HER-2蛋白在结直肠腺瘤中的表达（IHC×200）
 
Figure 9 The expression of HER-2 protein in the colorectal carcinoma (IHC×400）
图9  HER-2蛋白在结直肠癌中的表达(IHC×400）
 
2.6  HER-2蛋白在结直肠癌组织中的表达与临床病理特征的关系  HER-2的表达与结直肠癌的分化程度、分期和淋巴结转移有关(P<0.05)，HER-2阳性表达率在不同性别、年龄、肿瘤最大径的结直肠癌中的差别无显著性意义（P>0.05，见表3）。
Table 3  The relationship of the expression of HER-2 protein and clinicopathological features of colorectal cancers
表 3  HER-2蛋白在结直肠癌中的表达与临床病理特征的关系

Variable		N		HER-2			Positive rate (%)		X2	P
				+           -
Gender
Male	158		115		43	21.5		0.722			0.396
Female	93		63		30	28.0
Age（year）
≥50	218		158		60	72.5		1.958			0.162
<50	33		20		13	60.6
Diameter
≥3cm	180		132		48	73.3		1.802			0.179
<3cm	71		46		25	64.8
Differentiation
Well+medium	204		139		65	68.1		4.08			0.043
Worse	47		39		8	83
Lymphatic metastasis
N	166		108		58	65.1		8.15			0.04
Y	85		70		15	82.4
Stage
I+II	169		104		65	61.5		22.058			<0.0001
III+IV	82		74		8	90.2

3  讨论
随着生活水平不断升高，人们饮食结构发生改变，结直肠癌已经成为严重威胁国人生命健康的恶性肿瘤之一。研究表明结直肠癌的发生、发展是多因素、多阶段、多基因改变共同作用的结果。正常细胞在形态、结构发生改变之前，必然经历一个分子生物学、生化结构方面的变化。有研究发现：SGLT-1作为一种转运载体主要功能是介导葡萄糖和半乳糖的吸收，近年来发现SGLT-1可促进肿瘤细胞对葡萄糖的吸收为其生长提供营养。一般认为，高分化的结直肠癌细胞侵袭、转移的能力低于分化差的结直肠癌细胞，也常常一定程度上提示预后较佳。Hanabata Y在口腔鳞状细胞癌的研究中发现EGFR与SGLT-1蛋白均过度表达且二者的表达成正相关，由此认为EGFR可能通过增强SGLT-1的稳定性促进其表达，进而促进了肿瘤细胞对葡萄糖的摄取^[2]。Helmke BM研究发现SGLT1在中、高分化头颈部鳞癌组织中呈低表达，低分化肿瘤组织中呈高表达，SGLT1表达与头颈部鳞癌分化有关，可作为头颈部鳞癌分化标记物^[3]。本实验结果中，SGLT-1在结直肠癌中高表达，提示SGLT-1蛋白的表达在结直癌的发生中有促进作用。SGLT-1蛋白的表达水平与结直肠癌的分化程度有关，在高-中分化的肿瘤中的表达水平低于其在低分化的肿瘤中的表达。提示，SGLT-1不仅为肿瘤的生长提供能量通道，而且与肿瘤细胞的分化有关，可以作为评估结直肠癌细胞分化程度的一项生物学指标。
EGFR和HER-2具有同源性，在结构和功能上均相似，可接受表皮生长因子样物质的信息，具有酪氨酸激酶的活性，通过不同的信号传导通路，最终导致细胞无序增殖和恶性转化。Engelman JA等发现EGFR可以通过激活酪氨酸激酶促进肿瘤细胞的增殖，从而促进肿瘤细胞的生长^[4,5]。国内外的大量研究均认为结直肠癌组织中EGFR的表达程度随着侵犯深度的不同而不同，侵犯越深，表达程度也越高。Spano等人研究发现EGFR的高表达与TNM分期有关。说明结直肠癌中，EGFR的表达程度和肿瘤侵犯深度及淋巴结转移情况和肿瘤分期等有密切联系。尤其在淋巴结及肝脏的转移灶EGFR表达程度要高于原发灶 ^[6,7,8]。EGFR的过表达与结直肠癌的较晚分期有联系已经被很多的资料表明，并且这也提示肿瘤有发生转移的潜在危险存在^[8]。本研究发现，EGFR蛋白在结直肠癌中高表达，提示其在结直肠癌的发生中有促进作用；其与结直肠的淋巴结转移和TNM分期有相关性。与Spano等的研究结果基本一致。
HER-2又称C-erbB-2基因，具有酪氨酸激酶活性。HER-2通过与家族中其它三位成员HER-1、HER-3、HER-4构成异源二聚体间接与配体连接，在同配体结合后可诱导细胞增殖等功能。HER-2扩增或超表达会使肿瘤细胞凋亡受到抑制而其生长受到促进^[9]，其机制为p185酪氨酸激酶使p34cdc2磷酸化(可使G2期DNA修复时间延长)或/和增强DNA修复酶的活性，能高效地修复DNA，使肿瘤细胞逃避凋亡而进入细胞周期下一阶段(S或M期)，由此可导致肿瘤细胞更多的抵抗对化疗和激素治疗的效果。因此，可以认为HER-2基因对肿瘤的发生和转移中有着重要作用。本研究中，HER-2 蛋白在结直肠癌中的表达明显高于其在腺瘤及正常粘膜中的表达，提示HER-2在结直肠癌的发生中可能起一定的促进作用。不仅如此，HER-2蛋白的表达还与结直肠的肿瘤分化程度、淋巴结转移和TNM分期有相关性。
总之，本实验应用免疫组织化学技术，对结直肠癌中SGLT-1、EGFR、HER-2的表达进行检测分析，结果显示三者在结直肠癌的发生发展过程中发挥重要作用。
 
 
 参考文献
1 Peter MR. Should HER-2 status be routinely measured for breast cancer patients [J]. Semin Oncol. 1999; 26(12): 117-23.
2 Hanabata Y. Expression analysis of EGFR and SGLT-1 in oral                         squamous cell carcinoma[J]. Kokubyo Gakkai Zasshi. 2011; 78(1): 12-8.
3 Helmke BM, Reisser C, Idzko M, et al. Expression of SGLT-1 in preneoplastic and neoplastic lesions of the head and neck[J]. Oral Oncol. 2004; 40(1): 28-35.
4 Engelman JA, Cantley LC. A sweet new role for EGFR  in cancer[J]. Cancer Cell. 2008; 13(5): 375-6.
5 Weihua Z, Tsan R, Huang WC, et al. Survival of cancer cells is       maintained by EGFR independent of its kinase activity[J].  Cancer Cell. 2008; 13(5): 385-93.
6 Paredes-Zaglul A, Kang JJ, Essig YP, et a1. Analysis of  colorectal cancer by comparative genomic hybridization: evidence for induction of the metastatic phenotype by loss  of tumor suppressor gnnes[J]. Clin Cancer Res. 1998; 4(4):879-86.
7 Al-Mulla F, Keith WN, Pickford IR, et a1. Comparative  genomic hybridization analysis of primary celorectal carcinomas and their synchronous metastases[J]. Genes Chromosomes Cancer. 1999; 24(14): 306-14.
8 Goldstein NS, Armin M. Epidermal growth faotor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on cancer satage Ⅳ colon adenocarcinoma[J]. Cancer. 2001; 92(5): 1331-46.
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