摘要：目的：研究基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）在甲状腺乳头状癌（PTC）组织中的表达及其意义。方法：通过免疫组织化法对2009年至2015年在我院住院手术治疗的176例PTC患者的癌及癌旁组织标本的MMP-2和MT1-MMP进行检测，探究其其在PTC中的表达情况并分析与临床资料的相关性。结果：（1）MMP2在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达分别为67.04%(118/176)和13.6%（24/176），具有统计学差异（P<0.01）；MT1-MMP在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达分别为61.93%（109/176）和10.8%（19/176），具有统计学差异（P<0.01）。（2）MT1-MMP在PTC组织中的表达与肿瘤组织的淋巴结转移相关（P<0.05），与性别、年龄、临床分期、癌灶大小无关（P>0.05）；MMP-2在PTC组织中的表达与包膜浸润和淋巴结转移相关（P<0.05），与性别、年龄、临床分期、癌灶大小无相关性（P>0.05）。（3）MMP-2在PTC的表达与MT1-MMP呈正相关(P<0.01)。结论：MMP-2与MT1-MMP在PTC中的表达与癌灶包膜浸润及淋巴结转移相关，二者在肿瘤发展中有协同作用。
关键词：基质金属蛋白酶；甲状腺乳头状癌；浸润与迁移
Expression and significance of matrix metalloproteinase -2 and metalloproteinase -1 in papillary thyroid carcinoma
Abstract: Objective: To study the expression and significance of matrix metalloproteinase -2 and papillary -1 in thyroid carcinoma (PTC). Methods: the expression of -2 and -1 was detected by immunohistochemical method in 176 cases of PTC patients with PTC, and the matrix metalloproteinase was detected. Results: (1) 67.04% (118/176) and 13.6 24/176 expression of MMP2 in papillary thyroid cancer tissues and cancer adjacent tissues respectively, and the difference is significant (x2 2=104.302, P < 0.01); the expression of MT1-MMP in papillary thyroid cancer tissues and cancer adjacent tissues were 61.93 percent 109/176 and 10.8% 19/176, the difference has statistical significance (x2 2=99.420, P < 0.01). (2) the expression of MT1-MMP in PTC was associated with lymph node metastasis (P<0.05), and was associated with sex, age, clinical stage, tumor size (P>0.05), MMP-2 expression and lymph node metastasis (P<0.05). (3) the expression of MMP-2 in papillary thyroid carcinoma was positively correlated with the expression of MT1-MMP (r=0.305, P<0.01). Conclusion: the expression of MMP-2 and MT1-MMP in papillary thyroid carcinoma was correlated with the tumor invasion and lymph node metastasis.
Keywords: matrix metalloproteinase; papillary thyroid carcinoma；Infiltration and migration
甲状腺癌乳头状癌多见于年轻女性患者或儿童，其恶性程度较低 ^[1]。尽管甲状腺癌常生长较缓慢，可局限在甲状腺内多年，但有约50%的病人可出现癌细胞经腺内淋巴管扩散到腺体的其他部位以及局部淋巴结，引起预后不佳^[2~4]。研究表明^[5，6]，恶性肿瘤出现转移和侵袭的先决条件在于突破细胞基底膜及间质组成的一层组织学屏障。而基质金属蛋白酶家族（matrixmetalloproteinase，MMPs）则可通过降解这层屏障中的成分使这一层组织学屏障被破坏以及诱导免疫耐受等机制为癌灶转移及侵袭提供了条件。作为MMPs家族的一员， MMP-2可通过诱导新生血管形成，降解细胞外基质等多种作用在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等很多肿瘤的进展迁移中发挥作用^[11~13]。膜型基质金属蛋白酶-1(membrane-type matrix metalloproteinase,MT-MMP)则是MMPs中的一员，表达于细胞膜表面的一种金属蛋白酶，可通过将多种细胞外基质成分降解等、促进新生血管生成等机制来影响肿癌细胞的浸润、迁移、凋亡等过程。有相关研究显示^[7]，MMP-2与甲状腺乳头状癌的迁移、浸润相关。Deryugina等人 ^[8]研究表明，MMP-2与MT1-MMP两者在肿瘤组织中的表达存在相关性。这次研究我们通过对176例患者的甲状腺乳头状癌及癌旁组织中MMP-2与MT1-MMP的检测，观察其在PTC中的表达，分析其与临床病理特征的关系。
1资料与方法
1.1一般资料：选择2009年至2015年期间于本院本科室住院行手术治疗的176例PTC患者的术后甲状腺癌组织标本，所有标本均经病检最后诊断为PTC，并收集癌旁2cm的标本，所有标本均最后确定无肿瘤细胞存在。患者的平均年龄为42.7±3.2岁，18 ～69 岁；121例女性，55例男性；临床分期，130例患者为I~II期，46例患者为III~IV期； 63例患者瘤灶最大径超过2厘米，113例患者最大径小于2厘米；淋巴结转移：82例患者未见，94例患者有。
1.2材料和试剂：SP试剂盒、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液（strept avidin-biotin complex,SABC）、鼠抗人MMP-2单抗（1∶100稀释）均购自研生公司（上海）；鼠抗人MT1-MMP多抗体购自Lab Vision公司（1∶100稀释，上海）；阳性切片购自研生生化公司（上海），MMP-2相对应的为胎盘滋养叶细胞，MT1-MMP相对应的为则为大鼠脾脏。
1.3临床病理资料收集：收集患者的性别、年龄、临床分期、癌灶大小、癌灶包膜浸润情况及淋巴结转移情况，并分析这些临床资料与MT1-MMP和MMP-2在PTC中表达的相关关系。
1.4检测方法：MT1-MMP和MMP-2在组织中的表达通过免疫组化SP法检测。甲醛溶液（10％）固定标本后予以石蜡包埋及连续切片，片4um厚。切片脱蜡至水后行高压热修复。H₂O₂溶液（3％）将过氧化物酶阻断，将鼠抗人MMP-2单抗与MT1-MMP多抗加入并进行反应，4℃过夜，磷酸盐缓冲液冲洗，加入生物素化二抗液，放置10min（室温），滴加SABC液，再放置10分钟（37℃），磷酸盐缓冲液冲洗，DAB显色，蒸馏水洗后予以苏木精复染。阴性对照采取磷酸盐缓冲液替代一抗，购买的阳性切片（已知）作为阳性对照。
1.3结果判断： MT1-MMP与MMP-2在免疫组化实验中阳性表达部位均为胞浆，表达阳性强度表现为从浅黄色~棕褐色。按照半定量积分法^[9]，联合阳性细胞染色强度和阳性细胞百分率。阳性物质染色强度判定评分：3分：胞浆染色是棕褐色，2分：胞浆染色是棕黄色，1分：胞浆染色是浅黄色，0分：胞浆没有着色；阳性细胞百分率判定评分标准：0分：染色细胞无或低于5%；1分：染色细胞为5%～25%；2分：染色细胞为25%～50%；3分：染色细胞超过50%。
1.5统计学方法：采用SPSS17.0进行数据分析，定性资料采用χ²检验，相关关系分析采用pearson spearma检验。按α=0.05的检验水准，以P＜0.05为有统计学差异。
2结果
2.1 甲状腺乳头状癌和癌旁组织中MMP-2与MT1-MMP的表达：
MMP2在PTC和癌旁组织阳性表达分别为67.04% (118/176)和13.6%（24/176），差异有统计学意义（χ²=104.302，P<0.01）；MT1-MMP在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达分别为61.93%（109/176）和10.8%（19/176），具有统计学差异（χ²=99.420，P<0.01）。见图1。
 
 
注：图A和图B分别为MT1-MMP在癌旁组织中阴性和阳性表达；图C和图D分别为癌组织中阴性和阳性表达。
图1.PTC和癌组织中MT1-MMP的表达(SP×200)
  
 
注：图E与图F分别为MMP-2在癌旁组织中阴性和阳性表达；图G和图H分别为癌组织中阴性和阳性表达。
图2.甲状腺乳头状癌旁组织和癌组织中MMP-2的表达(SP×200)
2.2 MT1-MMP 及 MMP-2 的表达与 PTC 临床病理特征的关系：
MT1-MMP在PTC组织中的表达与肿瘤组织的淋巴结转移相关（P<0.05），与性别、年龄、临床分期、癌灶大小无关（P>0.05）；MMP-2在PTC组织中的表达和包膜浸润及淋巴结转移相关（P<0.05），与性别、年龄、癌灶大小、临床分期没有关联（P>0.05）。见表1.
表1. 临床资料与MMP-2和MT1-MMP在PTC中表达的关系（例）

临床病理资料	N	MMP-2				MT1-MMP
		阳性	阳性率	χ2	P	阳性	阳性率	χ2	P
性别
女	121	79	65.3%	0.541	0.462	80	66.1%	2.875	0.090
男	55	39	70.9%			29	52.73%
年龄
≥ 43	86	62	72.1%	1.541	0.214	57	66.3%	1.345	0.246
<43	90	57	63.3%			52	57.8%
临床分期
Ⅰ ~Ⅱ	130	84	64.6%	1.329	0.248	78	60.0%	0.787	0.375
Ⅲ~Ⅳ	46	34	73.9%			31	67.4%
肿瘤大小
>2 cm	63	44	69.8%	0.443	0.505	40	63.5%	0.150	0.697
≤ 2 cm	114	74	64.9%			69	60.5%
浸润包膜
有	73	57	78.1%	6.878	0.009	46	63.0%	0.062	0.803
无	103	61	59.2%			63	61.2%
淋巴结转移
有	94	73	77.7%	9.300	0.003	68	72.3%	9.271	0.002
无	82	46	56.1%			41	50.0%

2.3 MMP-2在PTC中的表达与MT1-MMP表达的相关性：由表2可知，MMP-2在甲状腺乳头状癌中的表达与MT1-MMP的表达呈正相关(r=0.305，P<0.01)，见表2。
表2. MMP-2与MT1-MMP在PTC中的表达关系（例）

MT1-MMP	MMP2		总计	r	P
	阳性	阴性
阳性	84	25	109
阴性	34	23	67	0.305	0.007
总计	118	58	176

3讨论
肿瘤的迁移和浸润的基质非常复杂，其中很重要的一步即细胞外基质屏障的破坏^[10]。细胞外基质成分包括纤维粘连蛋白、间质胶原、弹性蛋白等,并时刻在处于更新代谢中,对与其接触的癌基因的表达以及微环境的维持发挥重大作用,故破坏细胞外基质的更新代谢平衡失调的任何物质均可能影响肿瘤的浸润、迁移等过程^[12]。而MMPs则可通过对ECM的更新代谢平衡产生影响从而影响到肿瘤的浸润与迁移等过程。它可以降解各种数细胞外基质的成分在生理和病理过程发挥重要作用^[6，8]。多项研究表明^[13~15]，肺癌、胰腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的迁移和浸润均与MMPs活性的升高有关。相关研究表明[16]，MMP-2可以降解Ⅴ型、Ⅳ型胶原等细胞外基质成分，因此而破坏与肿瘤迁移、浸润相关的组织屏障，促进癌灶的迁移及生长。
Safar等人^[17] 通过分析并检测甲状腺乳头状癌病人标本MMP-2的表达后发现， MMP-2在PTC中表达和其包膜浸润存在一定关联。Wu等人^[18]发现，MMP-2在PTC中表达高于良性结节，而无淋巴结转移的病人癌组织中MMP-2的表达明显低于出现淋巴结转移患者。本研究中，MMP2在甲状腺乳头状癌组织中的表达为67.04% (118/176)，明显高于和癌旁组织中的表达13.6%（24/176）。进一步研究发现，MMP-2在PTC组织中的表达与包膜浸润及淋巴结转移相关（P<0.05），与性别、年龄、临床分期、癌灶大小无关（P>0.05）。这与吴立刚等人^[19]的结论一致。进一步表明MMP-2可能在PTC癌灶包膜浸润和淋巴结迁移中意义重大。
MT1-MMP为一种胶原酶, 活化后可将层粘连蛋白5和1、Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白、玻璃粘连蛋白等组成细胞外基质的多种大分子降解，与此同时还能够通过激活MMP-2从而达到对细胞外基质成分的降解作用^[12,16]。研究表明^[20], MT1-MMP在黑色素瘤、肝癌、肺癌、皮肤癌等恶性肿瘤中表现出高的阳性表达,并和癌细胞的浸润、迁移以及恶性程度等存在一定的关系。一个胃癌研究显示^[21]，胃癌病人静脉血中MT1-MMP的阳性表达与癌细胞的浸润及远处转移存在相关性。Ying-Chi等人^[22]，通过对肝细胞癌样本进行SP法检测发现,MT1-MMP高表达于癌及癌旁组织以及肝周静脉中。Yao等人^[23]研究表明，MT1-MMP在乳腺癌中的高表达通过对血管内皮生长因子-C的上调促进癌组织的血管和淋巴管的形成。
本研究中，MT1-MMP在甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织中的表达分别为61.93%（109/176）和10.8%（19/176）；MT1-MMP在PTC组织中的表达与肿瘤组织的淋巴结转移相关（P<0.05）。在二者关系探究中我们发现，MMP-2的表达与MT1-MMP呈正相关。这与刘章毅等人^[24]，研究结果一致。进一步提示，MMP-2与MT1-MMP对PTC迁移、浸润过程有协同作用。这与前述，MT1-MMP能够通过激活MMP-2从而使细胞外基质成分的降解，结论一致。
综上所述，MMP-2与MT1-MMP在PTC中的表达与癌灶包膜浸润及淋巴结转移相关，两者在肿瘤发展中有协同作用。
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