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精浆调控宫颈癌细胞血管生成因子分泌和促血管生成功能的作用及其
【摘要】 目的 研究精浆对宫颈癌细胞血管生成因子分泌和促血管生成功能的作用及其机制。 方法 ELISA实验用来检测细胞培养上清中VEGF、IL-8、CXCL1和MMP-9的表达；基质胶实验用来检测内皮细胞血管生成的功能。结果 精浆可以促进HeLa细胞分泌IL-8和CXCL1，使其含量分别增加了185%和148%，AKT信号通路的阻断则可以使其含量相对于精浆组分别下降61.4%和42.7%（P＜0.05）；而精浆对HeLa细胞VEGF和MMP-9的分泌没有显著的影响（P＞0.05）；对照上清组每个视野平均有2个血管网格形成，精浆上清组有9个血管网格形成，AKT阻断上清组只有4个血管网格形成，差异均有统计学意义（P＜0.05）。 结果 精浆可以促进宫颈癌细胞分泌促血管生成因子，进一步调控肿瘤的血管生成，AKT信号通路在这个过程中发挥着重要作用。
【关键词】 精浆；宫颈癌；血管生成；分泌
宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤，近几年其发病有年轻化的趋势。人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）持续感染是宫颈癌的主要危险因素，HPV可以通过环氧化酶-前列腺素通路促进宫颈癌的发生[1]。性生活频繁和多个性伴侣被认为与宫颈癌的发生和发展紧密相关，研究表明精液反复接触可以刺激肿瘤上皮细胞，激活胞内的炎症和血管生成信号通路，加速宫颈癌的进展[2]。然而其具体的机制还不是十分清楚，本文研究了精浆调控宫颈癌细胞促血管生成功能的作用及其机制，以期为临床治疗提供理论指导。
材料和方法
1. 材料 宫颈癌细胞株HeLa细胞和人脐静脉内皮细胞株购于美国ATCC公司；AKT抑制剂Tricirbine购于Sigma公司；VEGF、IL-8、CXCL1和MMP-9酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于欣博盛生物科技有限公司；基质胶购于美国BD公司；胰酶、DMEM/F-12基础培养基和胎牛血清购于美国Hyclone公司。
2. 精浆的提取 精液来自于本院10个健康男性，年龄跨度为18岁到25岁，平均年龄为21岁。提取的精液通过密度梯度离心分离出精浆，之后至于-80度的冰箱中保存。细胞实验中将分离出的精浆1：100稀释使用。
3. 细胞培养 HeLa细胞置于DMEM/F-12基础培养基加10%的胎牛血清中进行培养。取对数期的细胞，分成三组：对照组、精浆组和精浆加AKT抑制剂组。刺激24h后，弃掉培养基上清，PBS洗3次后，加入新鲜的培养基。继续培养48h，提取上清。ELISA实验用来检测上清中的VEGF、IL-8、CXCL1和MMP-9的含量，操作严格按照说明书进行。
4. 基质胶血管生成实验 96孔板每孔加入100ul预冷的基质胶，之后至于37度孵箱中备用。取对数期生长的内皮细胞，胰酶消化后按照之前提取的上清分组制成密度为1×105的细胞悬液，上清与细胞培养基的比值为1：3。将细胞悬液加入提前处理好的96孔板中，每孔为100ul，之后至于孵箱中培养。24小时后显微镜下观察血管生成的情况。
5. 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件分析。统计结果采用t检验，P值小于0.05被认为结果具有显著的统计学差异。
实验结果
1. 精浆对HeLa细胞血管生成因子分泌作用的影响 ELISA实验结果显示精浆可以促进HeLa细胞分泌IL-8和CXCL1，使其含量分别增加了185%和148%，AKT信号通路的阻断则可以抑制这一效果，使其含量相对于精浆组分别下降了61.4%和42.7%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。精浆的处理对HeLa细胞VEGF和MMP-9的分泌没有显著的影响，差异没有统计学意义（P＞0.05）。（见图1）
图1 精浆对HeLa细胞血管生成因子分泌作用的影响（*与对照组比较，#与精浆组比较，P＜0.05，样本数=3）
2. HeLa细胞分泌上清对内皮细胞血管生成的影响 基质胶血管生成实验结果显示对照上清组每个视野平均有2个血管网格形成，精浆上清组有9个血管网形成，AKT阻断上清组只有4个血管网格形成，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见图2）
图2 HeLa细胞分泌上清对内皮细胞血管生成的影响（*与对照组比较，#与精浆组比较，P＜0.05，样本数=3）
讨论
血管生成在肿瘤的发生和转移中发挥着十分重要的作用，其活跃程度是肿瘤的组织病理分级和预后判断的重要指标[3]。我们的研究发现精浆可以促进宫颈癌细胞分泌IL-8和CXCL1等促血管生成因子，而这些因子被认为是细胞增殖、血管生成和肿瘤转移的重要调控因素。此外K.J. Sales等进行裸鼠移植实验结果发现精浆还可以激活宫颈癌的慢性炎症，促进肿瘤的发展[4]。因此，对于检测出宫颈癌或者宫颈癌前病变即宫颈重度上皮内瘤样病变的女性患者，应该减少甚至杜绝精液的反复接触，以降低精浆对宫颈癌发展的促进作用。
AkT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，约由480个氨基酸残基组成，其与血管生成紧密相关。AKT可以通过磷酸化肌动蛋白结合蛋白girdin/APE来促进内皮细胞的增殖和迁移，此外AKT还能通过促进血管内皮生长因子（VEGF）和缺氧诱导因子（HIF-1）等细胞因子的分泌来调控血管生成[5]。我们的研究发现AKT信号通路的阻断大大降低了精浆诱导的促血管生成因子的分泌，同时AKT抑制阻断上清组内皮细胞形成血管网的能力也大大的降低，这说明AKT信号通路可能是精浆促进宫颈癌细胞分泌促血管生成因子的重要途径，可以作为肿瘤血管靶向治疗的一个重要靶点，为临床抗肿瘤药物的研发提供了新的途径。
综上，我们的研究结果表明精浆可以促进宫颈癌细胞分泌促血管生成因子，进一步调控肿瘤的血管生成，AKT信号通路在这个过程中发挥着十分重要的作用。
参考文献
[1] 舒晓燕，袁明，王冬花，等. 死亡相关蛋白激酶在肿瘤组织中的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志，2012, 29(11)：2312-2313
[2] Sutherland JR, Sales KJ, Jabbour HN, et al. Seminal plasma enhances cervical adenocarcinoma cell proliferation and tumour growth in vivo[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e33848.
【关键词】 精浆；宫颈癌；血管生成；分泌
宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤，近几年其发病有年轻化的趋势。人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）持续感染是宫颈癌的主要危险因素，HPV可以通过环氧化酶-前列腺素通路促进宫颈癌的发生[1]。性生活频繁和多个性伴侣被认为与宫颈癌的发生和发展紧密相关，研究表明精液反复接触可以刺激肿瘤上皮细胞，激活胞内的炎症和血管生成信号通路，加速宫颈癌的进展[2]。然而其具体的机制还不是十分清楚，本文研究了精浆调控宫颈癌细胞促血管生成功能的作用及其机制，以期为临床治疗提供理论指导。
材料和方法
1. 材料 宫颈癌细胞株HeLa细胞和人脐静脉内皮细胞株购于美国ATCC公司；AKT抑制剂Tricirbine购于Sigma公司；VEGF、IL-8、CXCL1和MMP-9酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于欣博盛生物科技有限公司；基质胶购于美国BD公司；胰酶、DMEM/F-12基础培养基和胎牛血清购于美国Hyclone公司。
2. 精浆的提取 精液来自于本院10个健康男性，年龄跨度为18岁到25岁，平均年龄为21岁。提取的精液通过密度梯度离心分离出精浆，之后至于-80度的冰箱中保存。细胞实验中将分离出的精浆1：100稀释使用。
3. 细胞培养 HeLa细胞置于DMEM/F-12基础培养基加10%的胎牛血清中进行培养。取对数期的细胞，分成三组：对照组、精浆组和精浆加AKT抑制剂组。刺激24h后，弃掉培养基上清，PBS洗3次后，加入新鲜的培养基。继续培养48h，提取上清。ELISA实验用来检测上清中的VEGF、IL-8、CXCL1和MMP-9的含量，操作严格按照说明书进行。
4. 基质胶血管生成实验 96孔板每孔加入100ul预冷的基质胶，之后至于37度孵箱中备用。取对数期生长的内皮细胞，胰酶消化后按照之前提取的上清分组制成密度为1×105的细胞悬液，上清与细胞培养基的比值为1：3。将细胞悬液加入提前处理好的96孔板中，每孔为100ul，之后至于孵箱中培养。24小时后显微镜下观察血管生成的情况。
5. 统计学方法 应用SPSS12.0统计软件分析。统计结果采用t检验，P值小于0.05被认为结果具有显著的统计学差异。
实验结果
1. 精浆对HeLa细胞血管生成因子分泌作用的影响 ELISA实验结果显示精浆可以促进HeLa细胞分泌IL-8和CXCL1，使其含量分别增加了185%和148%，AKT信号通路的阻断则可以抑制这一效果，使其含量相对于精浆组分别下降了61.4%和42.7%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。精浆的处理对HeLa细胞VEGF和MMP-9的分泌没有显著的影响，差异没有统计学意义（P＞0.05）。（见图1）
图1 精浆对HeLa细胞血管生成因子分泌作用的影响（*与对照组比较，#与精浆组比较，P＜0.05，样本数=3）
2. HeLa细胞分泌上清对内皮细胞血管生成的影响 基质胶血管生成实验结果显示对照上清组每个视野平均有2个血管网格形成，精浆上清组有9个血管网形成，AKT阻断上清组只有4个血管网格形成，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见图2）
图2 HeLa细胞分泌上清对内皮细胞血管生成的影响（*与对照组比较，#与精浆组比较，P＜0.05，样本数=3）
讨论
血管生成在肿瘤的发生和转移中发挥着十分重要的作用，其活跃程度是肿瘤的组织病理分级和预后判断的重要指标[3]。我们的研究发现精浆可以促进宫颈癌细胞分泌IL-8和CXCL1等促血管生成因子，而这些因子被认为是细胞增殖、血管生成和肿瘤转移的重要调控因素。此外K.J. Sales等进行裸鼠移植实验结果发现精浆还可以激活宫颈癌的慢性炎症，促进肿瘤的发展[4]。因此，对于检测出宫颈癌或者宫颈癌前病变即宫颈重度上皮内瘤样病变的女性患者，应该减少甚至杜绝精液的反复接触，以降低精浆对宫颈癌发展的促进作用。
AkT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，约由480个氨基酸残基组成，其与血管生成紧密相关。AKT可以通过磷酸化肌动蛋白结合蛋白girdin/APE来促进内皮细胞的增殖和迁移，此外AKT还能通过促进血管内皮生长因子（VEGF）和缺氧诱导因子（HIF-1）等细胞因子的分泌来调控血管生成[5]。我们的研究发现AKT信号通路的阻断大大降低了精浆诱导的促血管生成因子的分泌，同时AKT抑制阻断上清组内皮细胞形成血管网的能力也大大的降低，这说明AKT信号通路可能是精浆促进宫颈癌细胞分泌促血管生成因子的重要途径，可以作为肿瘤血管靶向治疗的一个重要靶点，为临床抗肿瘤药物的研发提供了新的途径。
综上，我们的研究结果表明精浆可以促进宫颈癌细胞分泌促血管生成因子，进一步调控肿瘤的血管生成，AKT信号通路在这个过程中发挥着十分重要的作用。
参考文献
[1] 舒晓燕，袁明，王冬花，等. 死亡相关蛋白激酶在肿瘤组织中的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志，2012, 29(11)：2312-2313
[2] Sutherland JR, Sales KJ, Jabbour HN, et al. Seminal plasma enhances cervical adenocarcinoma cell proliferation and tumour growth in vivo[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e33848.