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长链非编码RNA HOTAIR在宫颈癌中的表达及对Hela细胞增殖和凋亡的
【摘要】目的 探讨长链非编码RNA HOTAIR在宫颈癌中的表达及对宫颈癌细胞系Hela细胞增殖和凋亡的影响。方法 收集36例宫颈癌手术切除标本（包括癌组织和癌旁组织），实时荧光定量PCR检测36例标本中HOTAIR的表达情况，分析其与临床病理特征的关系；用慢病毒介导siRNA干扰HOTAIR表达后，分别采用CCK-8法、流式细胞术检测其对细胞增殖、周期和凋亡的影响。结果 HOTAIR在宫颈癌肿瘤组织中的表达量为7.061±0.436，高于癌旁组织的2.214±0.189，差异有统计学意义（t=10.20，P＜0.001）；HOTAIR的表达水平与临床病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移密切相关，但与年龄、组织分类、分化水平、鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）、宫体转移等未见明显相关；HOTAIR的表达被干扰后，细胞增殖明显减慢，48h、72h和96h的抑制率分别为20%、24.6%、33.1%；细胞周期被阻滞于G0/G1期；HOTAIR干扰组细胞凋亡比例为（12.37±2.74）%，对照组细胞凋亡为（5.94±1.27）%，差异具有统计学意义（P<0.01）。结论 HOTAIR在宫颈癌组织中显著高表达，且能显著促进肿瘤细胞生长，可以作为宫颈癌诊断、判断预后的分子标志物和潜在的治疗靶点。
【关键词】长链非编码RNA；HOTAIR；宫颈癌；增殖；凋亡
Expression of long non-coding RNA HOTAIR in cervical cancer and its effects on Hela cell growth and apoptosis
Abstract To investigate the expression of long non-coding RNA HOTAIR in cervical cancer and its effects on Hela cell growth and apoptosis. Methods The expression of HOTAIR in 36 cervical cancer tissues and matched adjacent normal tissues were measured using quantitative real-time RT-PCR and its correlation with the clinical parameters was analyzed. Lentiviral mediated shRNA was used to knockdown HOTAIR in Hela cells to investigate its role in cell growth and apoptosis. Results HOTAIR expression in cervical cancer tissues was significantly upregulated compared with the matched nontumorous tissues (7.061±0.436 vs. 2.214±0.189; t=10.20，P＜0.001); Increased HOTAIR expression was significantly correlated with tumor size, tumor stage and lymph node metastasis, but not other clinical characteristics. Knockdown of HOTAIR significantly reduce cell growth, cell cycle arrest at G0/G1 phase, and promoted cell apoptosis. Conclusion High expression of HOTAIR is involved in cervical cancer progression and could be a potential target for diagnosis and gene therapy.
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤的第2位，是女性最常见的死因。长链非编码RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一类长度大于200nt的RNA分子，主要由RNA聚合酶Ⅱ转录，由于其自身缺乏明显的开放阅读框架，不参与蛋白质的编码功能，起初被认为是基因组转录的“噪音”[1]。但近来研究表明，LncRNA可通过染色质修饰、转录激活与干扰等参与包括肿瘤在内的多种细胞内信号调控过程[1]。HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是一个长2158nt的LncRNA，定位于人类12号染色体上HoxC11与HoxC12之间HOTAIR是第一个被发现的具有反式转录调控作用的LncRNA[2]。已有的研究表明HOTAIR与人类多种肿瘤如肝细胞癌、胰腺癌和大肠癌等的发生、发展以及转移密切相关[2-5]。目前尚未见HOTAIR在宫颈癌中的表达及功能机制相关研究，因此本研究通过分析LncRNA HOTAIR在宫颈癌及癌旁正常组织中的表达水平，探讨其与宫颈癌临床病理的相关性，并进一步研究其对宫颈癌细胞生物学功能的影响。
材料与方法
1. 临床资料 收集2011年9月至2013 年9月本院妇产科36例宫颈癌手术切除标本（包括癌组织和癌旁组织）。患者年龄32～73岁，平均年龄48.3岁。临床分期按国际妇产科联盟分期标准，包括26例I期和10例Ⅱ期。所有患者均未行术前放化疗，留取肿瘤组织及距肿瘤边缘>5 cm的正常组织，手术切除标本立即放入液氮保存，而后转入-80℃冰箱冻存，所有标本均经病理检查确诊。所有患者及家属均签署知情同意书。人宫颈癌细胞株Hela购自中科院保藏中心；胎牛血清，DMEM购自美国Gibco公司；RNA逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；携有干扰序列的慢病毒载体购自上海吉玛制药有限公司； CCK-8试剂盒购自江苏碧云天公司；Annxin-V/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物工程有限公司；ABI7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，BD FACS Calibur 流式细胞仪购自美国BD公司。
2. 总RNA抽提及荧光定量PCR 采用TRIzol法提取总RNA。取50～100 mg正确保存的冻存组织，放入盛有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，直至组织磨成粉末状，加入1 mL Trizol继续研磨，待液氮挥发后，用移液器反复吹打数次，装入EP管中，按TRIzol法说明书进行RNA抽提。抽提后的RNA用DEPC水溶解后采用分光光度计测定波长260、280 nm的吸收值，计算RNA浓度和纯度，RNA样品A260/A280在1.8～2.1 为合格，同时使用标准的变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性。RNA逆转录按照TaKaRa公司的Prime-ScriptTM逆转录试剂盒说明书指示两步法逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR按照STBR Green说明书配制反应体系，每个样本设３个复孔。所用引物序列如下：HOTAIR 上游引物：5-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3，下游引物：5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；内参GAPDH 上游引物：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′，下游引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。PCR反应条件：95℃ 5min预变性，95℃ 15s，60℃ 60s，共42个循环。使用2-ΔCt法计算HOTAIR在癌组织和癌旁组织中的表达量。
3. 细胞培养及慢病毒转染 Hela细胞用DMEM（含10%胎牛血清）培养基常规培养于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱，隔天传代，取对数生长期细胞进行慢病毒感染。慢病毒载体携带的２ 条干扰HOTAIR的序列分别为：UAACAAGACCAGAGAGCUGUU；GAACGGGAGUACAGAGAGAUU。以携带无意义序列的重组慢病毒载体LV-NC作为阴性对照。根据MOI=20加入病毒液，病毒转染24小时后换为普通培养基，以嘌呤霉素筛选２周用于下一步实验。
4. CCK8法检测细胞增殖 将稳定转染HOTAIR干扰序列和NC序列的Hela细胞按5×103/孔接种于96孔板，每组设置6个复孔，于接种后12、24、36、48、72、96h，以CCK8法于450nm波长处测定每组细胞的吸光度值。取6孔平均值为结果（A值），以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。HOTAIR对Hela细胞的抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。
5. 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 将1×105个细胞种于24孔板中，24h 后用不含EDTA的胰酶消化收集后，1000rpm/min 离心5min，弃上清，用预冷的PBS 洗涤２次后，重悬于75％乙醇并于-20℃固定过夜，洗涤离心后加入含有10 μg/mL溴化丙啶（PI）和0.1％RNase A的PBS液500μL，室温避光染色10 min后上流式细胞仪测定细胞周期。检测细胞凋亡时消化收集细胞，洗涤后重悬于200 μL的结合缓冲液中，加入10μL Annexin V-FITC和5μL的PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入300 μL结合缓冲液，流式细胞仪测定细胞凋亡情况，以百分数表示细胞凋亡率。
6. 统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差(
+S)表示，采用独立样本t检验，分类资料采用χ2检验或Fisher精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. HOTAIR在宫颈癌中的表达及与临床病理特征的关系 荧光定量PCR结果显示，HOTAIR在宫颈癌肿瘤组织中的表达量为7.061±0.436，高于癌旁组织的2.214±0.189，差异有统计学意义（t=10.20，P＜0.001），结果见图1。以HOTAIR相对表达量的中位值（4.42）为界，将36例样本分为高低表达两组，HOTAIR的表达水平与临床病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移密切相关，但与年龄、组织分类、分化水平、鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）、宫体转移等未见明显相关，结果见表1。
图1 HOTAIR在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达
表1 HOTAIR表达水平与临床病理参数之间的关系
2. HOTAIR对Hela细胞增殖的影响 CCK-8检测细胞增殖结果显示，48h开始干扰HOTAIR表达组细胞增殖明显慢于对照组细胞，48h、72h和96h的抑制率分别为20%、24.6%、33.1%。结果见图2。
图2 CCK8检测干扰HOTAIR对Hela细胞增殖的影响（*P＜0.05，**P＜0.01）
3. HOTAIR对Hela细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，siRNA-HOTAIR组细胞与siRNA-Control组细胞比较，G0/G1期细胞由（50.21±6.37）％增加到（61.09±4.22％（P<0.05），S期细胞由（33.69±2.41）％减少为（27.99±2.67）％（P<0.05），G2/M 期细胞由（16.10±2.11）%减少为（10.92±1.39）%（P<0.01），提示细胞周期阻滞于G0/G1期。结果见图3。
图3 流式细胞仪检测干扰HOTAIR对Hela细胞周期的影响（*P＜0.05，**P＜0.01）
4. HOTAIR对Hela细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，右上象限属于晚期凋亡细胞，右下象限属于早期凋亡细胞，右上象限和右下象限的细胞百分比总和为细胞凋亡比例，siRNA-HOTAIR组细胞凋亡比例为（12.37±2.74）%，siRNA-Control组细胞凋亡为（5.94±1.27）%，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果见图4。
图4 流式细胞仪检测干扰HOTAIR对Hela细胞凋亡的影响（**P＜0.01）
讨 论
LncRNA并不编码蛋白或者只是编码很短的多肽，曾一度被认为是基因组转录的“噪音”，但是目前越来越多的研究表明LncRNA在肿瘤的发生、发展过程中具有着重要的调节功能，一些异常表达的长链非编码RNA对肿瘤的诊断、治疗和预后判断均具有重要意义。在本研究中，我们发现lncRNA HOTAIR在宫颈癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，这与文献报道的结论相以一致，HOTAIR在多种肿瘤组织中如肝癌、乳腺癌、肠癌、肺癌中均上调表达[6]。我们的研究结果显示肿瘤组织的HOTAIR表达水平与临床病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移等密切相关，这一发现也与前人的报道相符合。Hajjari等发现在胃癌组织中上调表达的HOTAIR与肿瘤大小和淋巴结转移有关[7]，Geng等发现肝癌组织HOTAIR的表达量与HCC的复发及淋巴结转移密切相关[3]。
通过利用人宫颈癌细胞株Hela，我们进一步研究了HOTAIR在肿瘤细胞生物学功能的影响。我们利用siRNA干扰HOTAIR的表达后，能显著抑制Hela细胞的增殖，阻滞细胞周期在G0/G1期，同时诱导细胞凋亡，这些结果表明HOTAIR在宫颈癌的发生发展中发挥癌基因的作用。林梦洁等在非小细胞肺癌中沉默HOTAIR的表达后，可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[8]；Geng等发现干扰HOTAIR的表达后，肝癌细胞的增殖能力下降，MMP-9、VEGF的表达量也随之降低[3]。崔广晖等研究表明在食管鳞癌细胞EC9706中干扰HOTAIR表达后可以显著抑制细胞的增殖和侵袭、促进细胞的凋亡[9]。因此HOTAIR参与了肿瘤的增殖、凋亡、迁移和侵袭等各个环节，因此可以作为判断宫颈癌疾病程度和预后的重要生物标记物。
尽管HOTAIR在肿瘤发生发展中的作用以及被广泛研究并得到统一的结论，然而关于作用的分子机制却未完全阐明。HOTAIR定位于人染色体12q13.13的HoxC11与HoxC12之间的位点上，研究表明HOTAIR5’端可以与染色质修饰复合体（PRC2）结合，3’端可以与组蛋白去甲基化酶1复合体结合，通过与肿瘤细胞增殖、凋亡或转移相关基因的组蛋白H3K27位点甲基化或H3K4me2去甲基化，从而导致这些基因的转录沉默或激活，最终导致肿瘤细胞的恶性增殖和转移[10, 11]。在本研究中，我们选择GAPDH作为内参基因，尽管一些报道提示GAPDH可能会在一些肿瘤组织中上调表达，而且化疗会导致其水平下调，但是在本研究中我们发现GAPDH的水平在宫颈癌中的表达相对比较稳定，因此可以作为HOTAIR的内参基因。
综上所述，本研究结果表明HOTAIR在宫颈癌组织中表达上调，且与肿瘤的大小、转移密切相关，干扰HOTAIR的表达后能显著抑制肿瘤的细胞的增殖和凋亡，表明HOTAOR在宫颈癌的发生发展中发挥癌基因的作用，可以作为宫颈癌诊断、判断预后的分子标志物和潜在的治疗靶点，但是其转录调控机制尚待进一步研究。
参考文献
[1] Yang G, Lu X, Yuan L. LncRNA: A link between RNA and cancer [J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1839(11): 1097-1109.
[2] 曹林平, 吴健, 郑树森. 长链非编码RNA HOTAIR在肿瘤中的研究进展 [J]. 中国医药科学, 2013, 13): 28-31,48.
[3] YJ G, SL X, Q L, et al. Large Intervening Non-coding RNA HOTAIR is Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression [J]. The Journal of international medical research, 2011, 39(6): 2119-2128.
[4] Kim K, Jutooru I, Chadalapaka G, et al. HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibits pro-oncogenic activity in pancreatic cancer [J]. Oncogene, 2013, 32(13): 1616-1625.
[5] R K, T S, K M, et al. Long noncoding RNA HOTAIR regulates polycomb-dependent chromatin modification and is associated with poor prognosis in colorectal cancers [J]. Cancer research, 2011, 71(20): 6320-6326.
[6] The long non-coding RNA HOTAIR indicates a poor prognosis and promotes metastasis in non-small cell lung cancer [J]. 2013,
[7] Hajjari M, Behmanesh M, Sadeghizadeh M, et al. Up-regulation of HOTAIR long non-coding RNA in human gastric adenocarcinoma tissues [J]. Med Oncol, 2013, 30(3): 670.
[8] 林梦洁, 陈志强, 尹凌帝, 等. 长链非编码RNA HOTAIR对非小细胞肺癌迁移和侵袭能力的影响 [J]. 临床肿瘤学杂志, 2014, 8): 684-689.
[9] 崔广晖, 崔明威, 李宇航, 等. 长链非编码RNA HOTAIR对食管鳞癌细胞EC9706恶性生物学行为的影响 [J]. 中华实验外科杂志, 2014, 31(8): 1657-1658.
[10] Sheppard T L. DNA demethylation: lncRNA express delivery [J]. Nat Chem Biol, 2014, 10(10): 794.
[11] Wu S C, Kallin E M, Zhang Y. Role of H3K27 methylation in the regulation of lncRNA expression [J]. Cell Res, 2010, 20(10): 1109-1116.
【关键词】长链非编码RNA；HOTAIR；宫颈癌；增殖；凋亡
Expression of long non-coding RNA HOTAIR in cervical cancer and its effects on Hela cell growth and apoptosis
Abstract To investigate the expression of long non-coding RNA HOTAIR in cervical cancer and its effects on Hela cell growth and apoptosis. Methods The expression of HOTAIR in 36 cervical cancer tissues and matched adjacent normal tissues were measured using quantitative real-time RT-PCR and its correlation with the clinical parameters was analyzed. Lentiviral mediated shRNA was used to knockdown HOTAIR in Hela cells to investigate its role in cell growth and apoptosis. Results HOTAIR expression in cervical cancer tissues was significantly upregulated compared with the matched nontumorous tissues (7.061±0.436 vs. 2.214±0.189; t=10.20，P＜0.001); Increased HOTAIR expression was significantly correlated with tumor size, tumor stage and lymph node metastasis, but not other clinical characteristics. Knockdown of HOTAIR significantly reduce cell growth, cell cycle arrest at G0/G1 phase, and promoted cell apoptosis. Conclusion High expression of HOTAIR is involved in cervical cancer progression and could be a potential target for diagnosis and gene therapy.
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤的第2位，是女性最常见的死因。长链非编码RNA（long non-coding RNA, LncRNA）是一类长度大于200nt的RNA分子，主要由RNA聚合酶Ⅱ转录，由于其自身缺乏明显的开放阅读框架，不参与蛋白质的编码功能，起初被认为是基因组转录的“噪音”[1]。但近来研究表明，LncRNA可通过染色质修饰、转录激活与干扰等参与包括肿瘤在内的多种细胞内信号调控过程[1]。HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是一个长2158nt的LncRNA，定位于人类12号染色体上HoxC11与HoxC12之间HOTAIR是第一个被发现的具有反式转录调控作用的LncRNA[2]。已有的研究表明HOTAIR与人类多种肿瘤如肝细胞癌、胰腺癌和大肠癌等的发生、发展以及转移密切相关[2-5]。目前尚未见HOTAIR在宫颈癌中的表达及功能机制相关研究，因此本研究通过分析LncRNA HOTAIR在宫颈癌及癌旁正常组织中的表达水平，探讨其与宫颈癌临床病理的相关性，并进一步研究其对宫颈癌细胞生物学功能的影响。
材料与方法
1. 临床资料 收集2011年9月至2013 年9月本院妇产科36例宫颈癌手术切除标本（包括癌组织和癌旁组织）。患者年龄32～73岁，平均年龄48.3岁。临床分期按国际妇产科联盟分期标准，包括26例I期和10例Ⅱ期。所有患者均未行术前放化疗，留取肿瘤组织及距肿瘤边缘>5 cm的正常组织，手术切除标本立即放入液氮保存，而后转入-80℃冰箱冻存，所有标本均经病理检查确诊。所有患者及家属均签署知情同意书。人宫颈癌细胞株Hela购自中科院保藏中心；胎牛血清，DMEM购自美国Gibco公司；RNA逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；携有干扰序列的慢病毒载体购自上海吉玛制药有限公司； CCK-8试剂盒购自江苏碧云天公司；Annxin-V/PI细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物工程有限公司；ABI7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，BD FACS Calibur 流式细胞仪购自美国BD公司。
2. 总RNA抽提及荧光定量PCR 采用TRIzol法提取总RNA。取50～100 mg正确保存的冻存组织，放入盛有液氮的研钵中，边加液氮边研磨，直至组织磨成粉末状，加入1 mL Trizol继续研磨，待液氮挥发后，用移液器反复吹打数次，装入EP管中，按TRIzol法说明书进行RNA抽提。抽提后的RNA用DEPC水溶解后采用分光光度计测定波长260、280 nm的吸收值，计算RNA浓度和纯度，RNA样品A260/A280在1.8～2.1 为合格，同时使用标准的变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性。RNA逆转录按照TaKaRa公司的Prime-ScriptTM逆转录试剂盒说明书指示两步法逆转录成cDNA。实时荧光定量PCR按照STBR Green说明书配制反应体系，每个样本设３个复孔。所用引物序列如下：HOTAIR 上游引物：5-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3，下游引物：5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；内参GAPDH 上游引物：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′，下游引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。PCR反应条件：95℃ 5min预变性，95℃ 15s，60℃ 60s，共42个循环。使用2-ΔCt法计算HOTAIR在癌组织和癌旁组织中的表达量。
3. 细胞培养及慢病毒转染 Hela细胞用DMEM（含10%胎牛血清）培养基常规培养于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱，隔天传代，取对数生长期细胞进行慢病毒感染。慢病毒载体携带的２ 条干扰HOTAIR的序列分别为：UAACAAGACCAGAGAGCUGUU；GAACGGGAGUACAGAGAGAUU。以携带无意义序列的重组慢病毒载体LV-NC作为阴性对照。根据MOI=20加入病毒液，病毒转染24小时后换为普通培养基，以嘌呤霉素筛选２周用于下一步实验。
4. CCK8法检测细胞增殖 将稳定转染HOTAIR干扰序列和NC序列的Hela细胞按5×103/孔接种于96孔板，每组设置6个复孔，于接种后12、24、36、48、72、96h，以CCK8法于450nm波长处测定每组细胞的吸光度值。取6孔平均值为结果（A值），以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。HOTAIR对Hela细胞的抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。
5. 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 将1×105个细胞种于24孔板中，24h 后用不含EDTA的胰酶消化收集后，1000rpm/min 离心5min，弃上清，用预冷的PBS 洗涤２次后，重悬于75％乙醇并于-20℃固定过夜，洗涤离心后加入含有10 μg/mL溴化丙啶（PI）和0.1％RNase A的PBS液500μL，室温避光染色10 min后上流式细胞仪测定细胞周期。检测细胞凋亡时消化收集细胞，洗涤后重悬于200 μL的结合缓冲液中，加入10μL Annexin V-FITC和5μL的PI轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入300 μL结合缓冲液，流式细胞仪测定细胞凋亡情况，以百分数表示细胞凋亡率。
6. 统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件分析。计量资料以均数±标准差(
+S)表示，采用独立样本t检验，分类资料采用χ2检验或Fisher精确概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。结 果
1. HOTAIR在宫颈癌中的表达及与临床病理特征的关系 荧光定量PCR结果显示，HOTAIR在宫颈癌肿瘤组织中的表达量为7.061±0.436，高于癌旁组织的2.214±0.189，差异有统计学意义（t=10.20，P＜0.001），结果见图1。以HOTAIR相对表达量的中位值（4.42）为界，将36例样本分为高低表达两组，HOTAIR的表达水平与临床病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移密切相关，但与年龄、组织分类、分化水平、鳞状细胞癌相关抗原（SCC-Ag）、宫体转移等未见明显相关，结果见表1。
图1 HOTAIR在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达
表1 HOTAIR表达水平与临床病理参数之间的关系
|
Clinicopathological factor |
HOTAIR expression level | P value | |
| Low | High | ||
| Age | |||
| ≤35 | 7 | 8 | 0.821 |
| ＞35 | 9 | 12 | |
| Histology | |||
| Squamous | 13 | 18 | 0.451 |
| Adenocarcinoma | 3 | 2 | |
| Tumor stage | |||
| 1B1 | 14 | 10 | 0.002 |
| 1B2-IIa | 2 | 4 | |
| IIb | 0 | 6 | |
| Differentiation | |||
| Well | 1 | 1 | 0.527 |
| Moderate | 11 | 10 | |
| Poor | 4 | 9 | |
| SCC-Ag (μg/L) | |||
| ≤4 | 14 | 17 | 0.829 |
| ＞4 | 2 | 3 | |
| Tumor diameter (cm) | |||
| ≤4 | 13 | 8 | 0.013 |
| ＞4 | 3 | 12 | |
| Uterine corpus invasion | |||
| Negative | 10 | 13 | 0.877 |
| Positive | 6 | 7 | |
| Lymphoid node | |||
| Negative | 15 | 12 | 0.020 |
| Positive | 1 | 8 | |
图2 CCK8检测干扰HOTAIR对Hela细胞增殖的影响（*P＜0.05，**P＜0.01）
3. HOTAIR对Hela细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，siRNA-HOTAIR组细胞与siRNA-Control组细胞比较，G0/G1期细胞由（50.21±6.37）％增加到（61.09±4.22％（P<0.05），S期细胞由（33.69±2.41）％减少为（27.99±2.67）％（P<0.05），G2/M 期细胞由（16.10±2.11）%减少为（10.92±1.39）%（P<0.01），提示细胞周期阻滞于G0/G1期。结果见图3。
图3 流式细胞仪检测干扰HOTAIR对Hela细胞周期的影响（*P＜0.05，**P＜0.01）
4. HOTAIR对Hela细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，右上象限属于晚期凋亡细胞，右下象限属于早期凋亡细胞，右上象限和右下象限的细胞百分比总和为细胞凋亡比例，siRNA-HOTAIR组细胞凋亡比例为（12.37±2.74）%，siRNA-Control组细胞凋亡为（5.94±1.27）%，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果见图4。
图4 流式细胞仪检测干扰HOTAIR对Hela细胞凋亡的影响（**P＜0.01）
讨 论
LncRNA并不编码蛋白或者只是编码很短的多肽，曾一度被认为是基因组转录的“噪音”，但是目前越来越多的研究表明LncRNA在肿瘤的发生、发展过程中具有着重要的调节功能，一些异常表达的长链非编码RNA对肿瘤的诊断、治疗和预后判断均具有重要意义。在本研究中，我们发现lncRNA HOTAIR在宫颈癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，这与文献报道的结论相以一致，HOTAIR在多种肿瘤组织中如肝癌、乳腺癌、肠癌、肺癌中均上调表达[6]。我们的研究结果显示肿瘤组织的HOTAIR表达水平与临床病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移等密切相关，这一发现也与前人的报道相符合。Hajjari等发现在胃癌组织中上调表达的HOTAIR与肿瘤大小和淋巴结转移有关[7]，Geng等发现肝癌组织HOTAIR的表达量与HCC的复发及淋巴结转移密切相关[3]。
通过利用人宫颈癌细胞株Hela，我们进一步研究了HOTAIR在肿瘤细胞生物学功能的影响。我们利用siRNA干扰HOTAIR的表达后，能显著抑制Hela细胞的增殖，阻滞细胞周期在G0/G1期，同时诱导细胞凋亡，这些结果表明HOTAIR在宫颈癌的发生发展中发挥癌基因的作用。林梦洁等在非小细胞肺癌中沉默HOTAIR的表达后，可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[8]；Geng等发现干扰HOTAIR的表达后，肝癌细胞的增殖能力下降，MMP-9、VEGF的表达量也随之降低[3]。崔广晖等研究表明在食管鳞癌细胞EC9706中干扰HOTAIR表达后可以显著抑制细胞的增殖和侵袭、促进细胞的凋亡[9]。因此HOTAIR参与了肿瘤的增殖、凋亡、迁移和侵袭等各个环节，因此可以作为判断宫颈癌疾病程度和预后的重要生物标记物。
尽管HOTAIR在肿瘤发生发展中的作用以及被广泛研究并得到统一的结论，然而关于作用的分子机制却未完全阐明。HOTAIR定位于人染色体12q13.13的HoxC11与HoxC12之间的位点上，研究表明HOTAIR5’端可以与染色质修饰复合体（PRC2）结合，3’端可以与组蛋白去甲基化酶1复合体结合，通过与肿瘤细胞增殖、凋亡或转移相关基因的组蛋白H3K27位点甲基化或H3K4me2去甲基化，从而导致这些基因的转录沉默或激活，最终导致肿瘤细胞的恶性增殖和转移[10, 11]。在本研究中，我们选择GAPDH作为内参基因，尽管一些报道提示GAPDH可能会在一些肿瘤组织中上调表达，而且化疗会导致其水平下调，但是在本研究中我们发现GAPDH的水平在宫颈癌中的表达相对比较稳定，因此可以作为HOTAIR的内参基因。
综上所述，本研究结果表明HOTAIR在宫颈癌组织中表达上调，且与肿瘤的大小、转移密切相关，干扰HOTAIR的表达后能显著抑制肿瘤的细胞的增殖和凋亡，表明HOTAOR在宫颈癌的发生发展中发挥癌基因的作用，可以作为宫颈癌诊断、判断预后的分子标志物和潜在的治疗靶点，但是其转录调控机制尚待进一步研究。
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