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Survivin和MMP-9在卵巢上皮癌中的表达及生物学意义
摘要 目的 研究Survivin和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在卵巢上皮癌组织中的表达及生物学意义，为临床早期诊断提供依据。方法 选择本院2013年1月～2014年6月卵巢上皮癌患者56例（观察组），Ⅰ+ Ⅱ级26例, Ⅲ+ Ⅳ级31 例；高、中和低分化分别20例、19例和17例。选择良性卵巢上皮肿瘤组织42例（对照组），正常卵巢组织24例（正常组）。应用免疫组化法观察各组组织中Survivin和MMP-9蛋白的表达水平。结果Survivin 蛋白主要在细胞核中表达，MMP-2蛋白主要在细胞浆和(或)间质中表达；观察组卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.16±0.81和2.20±0.63，均高于对照组1.42±0.76和1.46±0.34，也高于正常组0.60±0.38和0.73±0.29，差异具有统计学意义（p＜0.05）。且对照组Survivin和MMP-9蛋白OD值高于正常组，（P＜0.05）。Ⅲ+ Ⅳ级卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.52±0.65和2.61±0.82，均高于Ⅰ+ Ⅱ级1.26±0.33和1.34±0.56（P＜0.05）。低分化卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.70±0.62和2.80±0.71，均高于中分化组1.59±0.57和1.72±0.54，也高于高分化组1.04±0.28和1.15±0.32，差异具有统计学意义（p＜0.05）。中分化组Survivin和MMP-9蛋白OD值高于高分化组（P＜0.05）。结论 Survivin和MMP-9蛋白与卵巢上皮癌的发生、发展具有密切关系，随着分期的增加和分化程度的降低Survivin和MMP-9蛋白的表达逐渐增高。
关键词：卵巢上皮癌；Survivin；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）
卵巢上皮癌是一种妇科常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐渐上升趋势并趋于年轻化，临床早期无症状或症状较轻，多数患者就诊时已属于晚期。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类与肿瘤的发生、发展和转移关系密切的蛋白水解酶，可降解细胞外基质（ECM）和基底膜（BM），促进恶性肿瘤的血管形成以及侵袭和转移。基质金属蛋白酶-9（MMP-9），又称为Ⅳ型胶原酶，是MMPs家族中的重要组成部分。Survivin凋亡抑制蛋白家族的成员，其表达产物Survivin 蛋白选择性表达于乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中，对肿瘤细胞的生长、迁移、分化具有潜在的调控作用，与患者预后密切相关 [1-2]。本研究旨在探讨Survivin和MMP-9表达与卵巢上皮癌组织的关系及其临床意义，为临床早期诊断提供依据。
1 资料与方法
1.1一般资料 选择本院2013年1月-2014年6月卵巢上皮癌患者56例，患者年龄33～71岁，平均年龄（57.6±6.4）岁，所有标本均经病理确诊，术后切除卵巢上皮癌组织为观察组；良性卵巢上皮肿瘤组织42例（对照组），选取同期良性病变行卵巢手术的正常卵巢组织24例作为正常组。根据国际妇产科联盟(FIGO)组织学手术分期：Ⅰ+ Ⅱ级26例, Ⅲ+ Ⅳ级31 例；参照组织学分级：高、中和低分化分别20例、19例和17例。参照组织病理类型分类：浆液性乳头状囊腺癌21例，黏液性囊腺癌19例，子宫内膜样癌16例；所有患者均知情同意并经本院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和实验方法 [3-4]
1.2.1试剂与仪器 鼠抗人单克隆抗体MMP-9和鼠抗人Survivin单克隆抗体免疫组化试剂盒均购自武汉博士德公司；)、DAB显色试剂盒购自北京中山公司，MMP-9抗体工作浓度为1：100，Survivin 蛋白工作浓度为1：50；显微镜与照相机购自日本OLIMPUS公司。（武汉博士德公司）
1.2.2实验方法 MMP-9和Survivin蛋白表达均应用S-P免疫组化二步法，按试剂盒说明检测组织中MMP-9和Survivin蛋白的表达：采集样本后经4%福尔马林固定后，进行石蜡包埋，连续切片，DAB显色，脱水，透明和封片。用图像分析系统测定MMP-9和Survivin蛋白的光密度OD值，进行定量分析。
1.3 统计分析 采用SPSS13.0统计软件, 数据资料以均数±标准差（
±S ) 表示,采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。
2.结果
2.1 Survivin和MMP-9蛋白的表达结果 Survivin 蛋白主要在细胞核中表达，细胞核内有棕黄色颗粒的为Survivin蛋白阳性表达；MMP-2蛋白主要在细胞浆和(或)间质中表达，胞浆或细胞核内有棕黄色颗粒的为MMP-2蛋白阳性表达。
显微镜下观察，对照组MMP-2和Survivin 蛋白阳性细胞数量少，染色浅，呈弱表达；卵巢上皮癌组织细胞染色较深，呈强表达，随着分级的增加而增强。
2.2 各组组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较 本次实验结果显示，观察组卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.16±0.81和2.20±0.63，均高于对照组1.42±0.76和1.46±0.34，也高于正常组0.60±0.38和0.73±0.29，差异具有统计学意义（p＜0.05）。且对照组Survivin和MMP-9蛋白OD值高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。
表1 各组组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较（
±S）
▲与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；△与正常组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)
2.3 不同分级组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较 本次实验结果显示，Ⅲ+ Ⅳ级卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.52±0.65和2.61±0.82，均高于Ⅰ+ Ⅱ级1.26±0.33和1.34±0.56，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
表2 不同分级组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较（
±S）
▲与Ⅰ+ Ⅱ级卵巢上皮癌组织比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；
2.4 不同分化程度细胞Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较 本次实验结果显示，低分化卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.70±0.62和2.80±0.71，均高于中分化组1.59±0.57和1.72±0.54，也高于高分化组1.04±0.28和1.15±0.32，差异具有统计学意义（p＜0.05）。中分化组Survivin和MMP-9蛋白OD值高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
表3 不同分化程度细胞Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较（
±S）
▲与高分化卵巢上皮癌组织比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；△与中分化比较，差异具有统计学意义(P<0.05)
3 讨论
卵巢上皮癌是女性生殖系统器常见的恶性肿瘤之一，死亡率较高，预后差，寻找特异性的肿瘤标志物是卵巢癌研究的热点问题。Survivin 蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)基因家族的新成员，有研究显示在正常组织无表达或低表达。MMPs是一组锌离子依赖的重要蛋白水解酶，可降解基底膜及细胞外基质中的胶原蛋白，在肿瘤侵袭、转移过程中起着重要作用。有研究证实，在卵巢癌、乳腺癌等肿瘤组织中Survivin 蛋白和MMP-9均有不同程度表达，且其表达程度与恶性肿瘤的预后密切相关[5-6]。
本次实验结果显示，卵巢上皮癌、良性卵巢上皮组织和正常组织Survivin和MMP-9蛋白OD值逐渐降低，提示Survivin和MMP-9在肿瘤的恶性演变中发挥重要作用，可能导致其发生。MMP-9是一种相对分子质量最大的MMPs，属明胶酶，能降解细胞膜基质中的Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶，为肿瘤的生长、局部及远处的转移创造条件。Survivin 是近年来发现的抑制凋亡的新基因，能够抑制细胞凋亡并能调节细胞分化，可通过抑制caspases 活化，抑制细胞凋亡，参与细胞周期调控，促进细胞增殖、分裂和血管形成[7-8]。
肿瘤自身基底膜的完整性和肿瘤间质血管的形成在肿瘤浸润转移中起着重要作用，肿瘤的浸润、侵袭等需降解基底膜及细胞外基质，使肿瘤细胞突破自身基底膜，在局部增殖形成转移灶。本次调查结果显示，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级卵巢上皮癌组织细胞中的Survivin和MMP-9蛋白的表达逐渐增高，且随着分化程度的降低而增高，提示Survivin和MMP-9蛋白OD值的高表达与卵巢上皮癌发展密切相关，疾病的分期越晚、恶化程度越高，其阳性表达率越高。二者共同参与了卵巢上皮性癌的发生发展。Survivin蛋白表达升高，卵巢上皮癌细胞的凋亡抑制降低，使癌细胞不能正常凋亡而异常增生，导致卵巢上皮癌细胞活性增加。MMP- 9还能够影响卵巢肿瘤血管的形成，而肿瘤血管形成是肿瘤生长和转移的基础，MMP-9促进了卵巢上皮癌的发生并增强了卵巢上皮癌细胞的侵袭性[9-10]。因此，Survivin和MMP-9与肿瘤的发生发展、病理分级和分化密切相关， Survivin和MMP-9在卵巢上皮癌中的作用可能是相互协同的，共同促进了卵巢上皮癌的发展，促进肿瘤的侵袭、转移，在临床上可根据这两种蛋白阳性表达判断恶变程度。
综上所述，Survivin和MMP-9蛋白与卵巢上皮癌的发生、发展具有密切关系，随着分期的增加和分化程度的降低Survivin和MMP-9蛋白的表达逐渐增高。
参考文献
[1].俞维.c-Met 和MMP-2 在卵巢上皮癌中的表达及相关性研究[J].中国妇产科临床杂志,2010,11(6):440-442
[2].刘志慧,顾振鹏,马立新.PTEN 及Survivin 在卵巢上皮性癌中的表达及相关性[J].中国临床医学,2011,18(1):35-37
[3].郭冰沁,俞岚，武世伍.HE4、NF－κBp65和MMP－9在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志,2011,20(6):578-583
[4].Bongiovanni L, Di Diodoro F, Della Salda L,et al.On the role of survivin as a stem cell biomarker of canine hair follicle and related tumours[J].Vet Dermatol,2014,25(2):138-141
[5].申丽媛，唐良萏，张婧，等.WAVE1、MMP-2 及MMP-9 在卵巢癌组织中的表达及意义[J]. 第三军医大学学报, 2013,35(13):1406-1409
[6].Kuşku Cabuk F, Yığıt S, Demır L,et al.Correlation of survivin and MMP9 expressions with prognosis and clinicopathological parameters in surface epithelial ovarian carcinomas[J].Turk Patoloji Derg,2014,30(1):30-37
[7].杨琼娇,许淑媛,黄晓明，等.RUNX3和Surv iv in在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义[J].临床和实验医学杂志，2011，10(2)：87-89
[8].林红霞, 张弛,吴庆田,等.Surv ivin和MMP-9在子宫上皮和间质细胞中的表达与子宫内膜异位症间的关系[J].中国微生态学杂志,2011,23(6):519-524
[9].Umemori Y, Kuribayashi K, Nirasawa S, et al.Protein kinase C ζ regulates survivin expression and inhibits apoptosis in colon cancer[J].Int J Oncol,2014,45(3):1043-1050
[10].朱晓会.卵巢上皮性肿瘤中PTEN 和Survivin 的表达的意义[J].中国实用医药,2012,7(1):94-95
关键词：卵巢上皮癌；Survivin；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）
卵巢上皮癌是一种妇科常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐渐上升趋势并趋于年轻化，临床早期无症状或症状较轻，多数患者就诊时已属于晚期。基质金属蛋白酶（MMPs）是一类与肿瘤的发生、发展和转移关系密切的蛋白水解酶，可降解细胞外基质（ECM）和基底膜（BM），促进恶性肿瘤的血管形成以及侵袭和转移。基质金属蛋白酶-9（MMP-9），又称为Ⅳ型胶原酶，是MMPs家族中的重要组成部分。Survivin凋亡抑制蛋白家族的成员，其表达产物Survivin 蛋白选择性表达于乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中，对肿瘤细胞的生长、迁移、分化具有潜在的调控作用，与患者预后密切相关 [1-2]。本研究旨在探讨Survivin和MMP-9表达与卵巢上皮癌组织的关系及其临床意义，为临床早期诊断提供依据。
1 资料与方法
1.1一般资料 选择本院2013年1月-2014年6月卵巢上皮癌患者56例，患者年龄33～71岁，平均年龄（57.6±6.4）岁，所有标本均经病理确诊，术后切除卵巢上皮癌组织为观察组；良性卵巢上皮肿瘤组织42例（对照组），选取同期良性病变行卵巢手术的正常卵巢组织24例作为正常组。根据国际妇产科联盟(FIGO)组织学手术分期：Ⅰ+ Ⅱ级26例, Ⅲ+ Ⅳ级31 例；参照组织学分级：高、中和低分化分别20例、19例和17例。参照组织病理类型分类：浆液性乳头状囊腺癌21例，黏液性囊腺癌19例，子宫内膜样癌16例；所有患者均知情同意并经本院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和实验方法 [3-4]
1.2.1试剂与仪器 鼠抗人单克隆抗体MMP-9和鼠抗人Survivin单克隆抗体免疫组化试剂盒均购自武汉博士德公司；)、DAB显色试剂盒购自北京中山公司，MMP-9抗体工作浓度为1：100，Survivin 蛋白工作浓度为1：50；显微镜与照相机购自日本OLIMPUS公司。（武汉博士德公司）
1.2.2实验方法 MMP-9和Survivin蛋白表达均应用S-P免疫组化二步法，按试剂盒说明检测组织中MMP-9和Survivin蛋白的表达：采集样本后经4%福尔马林固定后，进行石蜡包埋，连续切片，DAB显色，脱水，透明和封片。用图像分析系统测定MMP-9和Survivin蛋白的光密度OD值，进行定量分析。
1.3 统计分析 采用SPSS13.0统计软件, 数据资料以均数±标准差（
±S ) 表示,采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。2.结果
2.1 Survivin和MMP-9蛋白的表达结果 Survivin 蛋白主要在细胞核中表达，细胞核内有棕黄色颗粒的为Survivin蛋白阳性表达；MMP-2蛋白主要在细胞浆和(或)间质中表达，胞浆或细胞核内有棕黄色颗粒的为MMP-2蛋白阳性表达。
显微镜下观察，对照组MMP-2和Survivin 蛋白阳性细胞数量少，染色浅，呈弱表达；卵巢上皮癌组织细胞染色较深，呈强表达，随着分级的增加而增强。
2.2 各组组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较 本次实验结果显示，观察组卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.16±0.81和2.20±0.63，均高于对照组1.42±0.76和1.46±0.34，也高于正常组0.60±0.38和0.73±0.29，差异具有统计学意义（p＜0.05）。且对照组Survivin和MMP-9蛋白OD值高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。
表1 各组组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较（
±S）| 组别 | 例数 | Survivin | MMP-9 |
| 正常组 | 24 | 0.60±0.38 | 0.73±0.29 |
| 对照组 | 42 | 1.42±0.76△ | 1.46±0.34△ |
| 观察组 | 56 | 2.16±0.81▲△ | 2.20±0.63▲△ |
2.3 不同分级组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较 本次实验结果显示，Ⅲ+ Ⅳ级卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.52±0.65和2.61±0.82，均高于Ⅰ+ Ⅱ级1.26±0.33和1.34±0.56，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
表2 不同分级组织Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较（
±S）| 组别 | 例数 | Survivin | MMP-9 |
| Ⅰ+ Ⅱ级 | 26 | 1.26±0.33 | 1.34±0.56 |
| Ⅲ+ Ⅳ级 | 31 | 2.52±0.65▲ | 2.61±0.82▲ |
2.4 不同分化程度细胞Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较 本次实验结果显示，低分化卵巢上皮癌组织Survivin和MMP-9蛋白OD值分别为2.70±0.62和2.80±0.71，均高于中分化组1.59±0.57和1.72±0.54，也高于高分化组1.04±0.28和1.15±0.32，差异具有统计学意义（p＜0.05）。中分化组Survivin和MMP-9蛋白OD值高于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
表3 不同分化程度细胞Survivin和MMP-9蛋白OD值结果比较（
±S）| 组别 | 例数 | Survivin | MMP-9 |
| 高分化 | 20 | 1.04±0.28 | 1.15±0.32 |
| 中分化 | 19 | 1.59±0.57▲ | 1.72±0.54▲ |
| 低分化 | 17 | 2.70±0.62▲△ | 2.80±0.71▲△ |
3 讨论
卵巢上皮癌是女性生殖系统器常见的恶性肿瘤之一，死亡率较高，预后差，寻找特异性的肿瘤标志物是卵巢癌研究的热点问题。Survivin 蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)基因家族的新成员，有研究显示在正常组织无表达或低表达。MMPs是一组锌离子依赖的重要蛋白水解酶，可降解基底膜及细胞外基质中的胶原蛋白，在肿瘤侵袭、转移过程中起着重要作用。有研究证实，在卵巢癌、乳腺癌等肿瘤组织中Survivin 蛋白和MMP-9均有不同程度表达，且其表达程度与恶性肿瘤的预后密切相关[5-6]。
本次实验结果显示，卵巢上皮癌、良性卵巢上皮组织和正常组织Survivin和MMP-9蛋白OD值逐渐降低，提示Survivin和MMP-9在肿瘤的恶性演变中发挥重要作用，可能导致其发生。MMP-9是一种相对分子质量最大的MMPs，属明胶酶，能降解细胞膜基质中的Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶，为肿瘤的生长、局部及远处的转移创造条件。Survivin 是近年来发现的抑制凋亡的新基因，能够抑制细胞凋亡并能调节细胞分化，可通过抑制caspases 活化，抑制细胞凋亡，参与细胞周期调控，促进细胞增殖、分裂和血管形成[7-8]。
肿瘤自身基底膜的完整性和肿瘤间质血管的形成在肿瘤浸润转移中起着重要作用，肿瘤的浸润、侵袭等需降解基底膜及细胞外基质，使肿瘤细胞突破自身基底膜，在局部增殖形成转移灶。本次调查结果显示，Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级卵巢上皮癌组织细胞中的Survivin和MMP-9蛋白的表达逐渐增高，且随着分化程度的降低而增高，提示Survivin和MMP-9蛋白OD值的高表达与卵巢上皮癌发展密切相关，疾病的分期越晚、恶化程度越高，其阳性表达率越高。二者共同参与了卵巢上皮性癌的发生发展。Survivin蛋白表达升高，卵巢上皮癌细胞的凋亡抑制降低，使癌细胞不能正常凋亡而异常增生，导致卵巢上皮癌细胞活性增加。MMP- 9还能够影响卵巢肿瘤血管的形成，而肿瘤血管形成是肿瘤生长和转移的基础，MMP-9促进了卵巢上皮癌的发生并增强了卵巢上皮癌细胞的侵袭性[9-10]。因此，Survivin和MMP-9与肿瘤的发生发展、病理分级和分化密切相关， Survivin和MMP-9在卵巢上皮癌中的作用可能是相互协同的，共同促进了卵巢上皮癌的发展，促进肿瘤的侵袭、转移，在临床上可根据这两种蛋白阳性表达判断恶变程度。
综上所述，Survivin和MMP-9蛋白与卵巢上皮癌的发生、发展具有密切关系，随着分期的增加和分化程度的降低Survivin和MMP-9蛋白的表达逐渐增高。
参考文献
[1].俞维.c-Met 和MMP-2 在卵巢上皮癌中的表达及相关性研究[J].中国妇产科临床杂志,2010,11(6):440-442
[2].刘志慧,顾振鹏,马立新.PTEN 及Survivin 在卵巢上皮性癌中的表达及相关性[J].中国临床医学,2011,18(1):35-37
[3].郭冰沁,俞岚，武世伍.HE4、NF－κBp65和MMP－9在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志,2011,20(6):578-583
[4].Bongiovanni L, Di Diodoro F, Della Salda L,et al.On the role of survivin as a stem cell biomarker of canine hair follicle and related tumours[J].Vet Dermatol,2014,25(2):138-141
[5].申丽媛，唐良萏，张婧，等.WAVE1、MMP-2 及MMP-9 在卵巢癌组织中的表达及意义[J]. 第三军医大学学报, 2013,35(13):1406-1409
[6].Kuşku Cabuk F, Yığıt S, Demır L,et al.Correlation of survivin and MMP9 expressions with prognosis and clinicopathological parameters in surface epithelial ovarian carcinomas[J].Turk Patoloji Derg,2014,30(1):30-37
[7].杨琼娇,许淑媛,黄晓明，等.RUNX3和Surv iv in在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义[J].临床和实验医学杂志，2011，10(2)：87-89
[8].林红霞, 张弛,吴庆田,等.Surv ivin和MMP-9在子宫上皮和间质细胞中的表达与子宫内膜异位症间的关系[J].中国微生态学杂志,2011,23(6):519-524
[9].Umemori Y, Kuribayashi K, Nirasawa S, et al.Protein kinase C ζ regulates survivin expression and inhibits apoptosis in colon cancer[J].Int J Oncol,2014,45(3):1043-1050
[10].朱晓会.卵巢上皮性肿瘤中PTEN 和Survivin 的表达的意义[J].中国实用医药,2012,7(1):94-95